12.1 સૂક્ષ્મદર્શન

જૈવિક અભ્યાસ અને શોધની કલ્પના સૂક્ષ્મદર્શક વિના કરી શકાતી નથી કારણ કે તે આપણને આપણી આંખોની પહોંચથી બહારની કોઈ વસ્તુ જોવા દે છે. આજે, સૂક્ષ્મદર્શનની તકનીક એટલી અદ્યતન બની ગઈ છે કે સંશોધક માત્ર ખૂબ જ સૂક્ષ્મ રચનાની ખૂબ વિસ્તૃત છબી જ જોઈ શકતો નથી પરંતુ આવી વસ્તુઓની ત્રિ-પરિમાણીય રચનાને પણ કલ્પના કરી શકે છે. શક્તિશાળી ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શન તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને, બેક્ટેરિયા અને વાઈરસના DNA અણુઓ પણ જોઈ શકાયા છે.

પ્રથમ સૂક્ષ્મદર્શકનો ઉપયોગ 1665નો છે જ્યારે બ્રિટિશ ભૌતિકશાસ્ત્રી રોબર્ટ હૂકે મોટું કરતા લેન્સના સંયોજનનો ઉપયોગ કરીને એક સરળ સૂક્ષ્મદર્શક ડિઝાઇન કર્યું (ફિગ. 12.1) અને કોર્કના સ્લાઇસ જોયા, અને તે મધપૂડા જેવી રચનાને સેલ્યુલે અથવા કોષ તરીકે નામ આપ્યું. તમે જાણો છો કે મેથિયાસ જેકબ શ્લેઇડેન અને થિયોડોર શ્વાને 1838માં છોડ અને પ્રાણીઓમાં કોષોના અવલોકનના આધારે કોષ સિદ્ધાંતનો પ્રસ્તાવ મૂક્યો હતો.

ફિગ. 12.1: સૂક્ષ્મદર્શક

12.1.1 વિસ્તૃતીકરણ અને રિઝોલ્યુશન

ચાલો હવે તે સિદ્ધાંત પર ધ્યાન કેન્દ્રિત કરીએ જેના પર સૂક્ષ્મદર્શનની તકનીક આધારિત છે. સૂક્ષ્મદર્શક જેવા ઓપ્ટિકલ ઉપકરણ માટે બે ઓપ્ટિકલ ગુણધર્મો અત્યંત મહત્વપૂર્ણ છે. એક છે મોટું કરવાની શક્તિ અને બીજી છે વિભેદન કરવાની ક્ષમતા.

સૂક્ષ્મદર્શકનું વિસ્તૃતીકરણ અથવા મોટું કરવાની શક્તિ એ તે ક્ષમતા છે જેના દ્વારા રેટિનલ છબીનું કદ વધારી શકાય છે. આમ સરળ શબ્દોમાં વિસ્તૃતીકરણ છે -

સૂક્ષ્મદર્શકની મદદથી રેટિનલ છબીનું કદ સૂક્ષ્મદર્શકનો ઉપયોગ કર્યા વિના રેટિનલ છબીનું કદ

તમે ભૌતિકશાસ્ત્રમાં અભ્યાસ કર્યો હશે કે લેન્સનું વિસ્તૃતીકરણ (M) નીચેના સૂત્રો અનુસાર માપવામાં આવે છે (જેમાં $f$ લેન્સની ફોકલ લંબાઈ છે અને $d$ લેન્સથી પદાર્થનું અંતર છે).

$$ M=\frac{f}{f-d} $$

સામાન્ય રીતે, પ્રયોગશાળામાં જે સૂક્ષ્મદર્શકનો ઉપયોગ થાય છે તે સંયુક્ત સૂક્ષ્મદર્શક છે જેમાં બે સેટ લેન્સ હોય છે. એકને ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સ કહેવામાં આવે છે, જે જોવાના પદાર્થની નજીક રહે છે, અને બીજું આઈપીસ છે જેના દ્વારા નિરીક્ષક જુએ છે. એ ઉલ્લેખ કરવાની જરૂર નથી કે પદાર્થ, ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સ, આઈપીસ અને નિરીક્ષકની આંખ પ્રકાશના માર્ગ માટે એક જ રેખામાં હોવી જરૂરી છે જેથી પદાર્થની વિસ્તૃત છબી જોઈ શકાય. સરળ શબ્દોમાં, સૂક્ષ્મદર્શકનું વિસ્તૃતીકરણ ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સની મોટું કરવાની શક્તિ અને આઈપીસની મોટું કરવાની શક્તિનું ગુણાકાર $\left(\mathrm{M} _{\mathrm{o}} \times \mathrm{M} _{\mathrm{e}}\right)$ છે.

વિભેદન શક્તિ સૂક્ષ્મદર્શકનો બીજો મહત્વપૂર્ણ ગુણધર્મ છે, જે એકબીજાની ખૂબ નજીક સ્થિત બે પદાર્થોની અલગ છબીઓ બનાવવાની ક્ષમતા છે. તે બે બિંદુઓ વચ્ચેના નાનામાં નાના અંતર દ્વારા માપી શકાય છે.

12.1.2 પ્રકાશ સૂક્ષ્મદર્શકનું કાર્ય

તમે પહેલાના વર્ગમાં સંયુક્ત સૂક્ષ્મદર્શકની રચના વિશે પહેલેથી જ અભ્યાસ કર્યો છે, છતાં પુનરાવર્તન કરવા માટે, જેમ તમે ફિગ. 12.1 માં જોઈ શકો છો, સંયુક્ત સૂક્ષ્મદર્શકમાં એક આધાર હોય છે જેના પર એક સ્ટેજ મધ્યમાં છિદ્ર સાથે ફિટ કરવામાં આવે છે. આધાર સાથે એક હાથ જોડાયેલો હોય છે જેના પર બોડી ટ્યુબ એવી રીતે ફિટ કરવામાં આવે છે કે તે સ્ટેજના છિદ્ર સાથે સંરેખિત થાય. બોડી ટ્યુબના નીચલા છેડે, નોઝ પીસ ફિટ કરવામાં આવે છે જેના પર બે થી ચાર ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સ હોઈ શકે છે. નોઝ પીસને ફેરવીને, ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સમાંથી એકને સ્ટેજ પર હાજર છિદ્રની ઉપર મૂકી શકાય છે જ્યાં જોવાનો પદાર્થ કાચના સ્લાઇડ પર મૂકવામાં આવે છે. બોડી ટ્યુબના ઉપરના છેડે, એક આઈપીસ ફિટ કરવામાં આવે છે જેના દ્વારા નિરીક્ષક સૂક્ષ્મદર્શક હેઠળ જોઈ શકે છે. હાથ પર એડજસ્ટમેન્ટ સ્ક્રૂ (ખરબચડા અને સૂક્ષ્મ) હોય છે જે સ્ટેજ પર હાજર પદાર્થથી ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સના અંતરને સમાયોજિત કરવામાં સહાય કરે છે. સ્ટેજની નીચે, પ્રકાશનો સ્ત્રોત હોય છે (જે પ્રતિબિંબિત અરીસો અથવા બલ્બ હોઈ શકે છે જે પદાર્થને પ્રકાશિત કરે છે અને ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સ અને આઈપીસ દ્વારા છબીની રચનાની સુવિધા આપે છે). ઉપરાંત, પ્રકાશ સ્ત્રોત અને સ્ટેજ વચ્ચે કન્ડેન્સર હાજર હોય છે, જે પદાર્થ પર પ્રકાશ કેન્દ્રિત કરવા માટે મહત્વપૂર્ણ છે. ફિગ. 12.2 સંયુક્ત સૂક્ષ્મદર્શકમાં પ્રકાશના માર્ગને પણ દર્શાવે છે. તમે જોયું હશે કે ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સ અને આઈપીસ બંનેની મોટું કરવાની શક્તિ અલગ અલગ હોય છે. વિદ્યાર્થી સૂક્ષ્મદર્શકમાં આઈપીસની મોટું કરવાની શક્તિ $10 \times$ અથવા $15 x$ હોય છે અને નોઝ પીસ પર ફિટ કરેલા વિવિધ ઑબ્જેક્ટિવ લેન્સની $4 \times$, $10 x, 40 / 45 x$ અને $100 x$ હોય છે. હમણાં જ ચર્ચા કરેલ સૂક્ષ્મદર્શનની તકનીકને તેજસ્વી ક્ષેત્ર સૂક્ષ્મદર્શન પણ કહેવામાં આવે છે કારણ કે જોવાના પદાર્થને પ્રકાશિત કરવા માટે પ્રકાશનો ઉપયોગ થાય છે. તેથી, પદાર્થના વિવિધ પ્રદેશોને અલગ પાડવા માટે, તેને વિશિષ્ટ રંગો અથવા સ્ટેન સાથે રંગવામાં આવે છે. કાર્મિન, ઇઓસિન, સેફ્રેનિન, મિથાઇલીન બ્લુ, જીમ્સા, વગેરે, પ્રકાશ સૂક્ષ્મદર્શન માટે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા થોડા સ્ટેન છે.

ફિગ. 12.2: પ્રકાશ સૂક્ષ્મદર્શક

12.1.3 સૂક્ષ્મદર્શનના વિવિધ સ્વરૂપો

ઊતકો / કોષોના આંતરિક સંગઠનની સૂક્ષ્મ વિગતોનો અભ્યાસ એટલો વૈવિધ્યસભર છે કે તે માત્ર પ્રકાશ સૂક્ષ્મદર્શન દ્વારા પ્રાપ્ત કરી શકાતો નથી. તેથી, એક અથવા બીજા પ્રકારની યુક્તિ કરીને, એકદમ વિવિધ સ્વરૂપોના સૂક્ષ્મદર્શનનો ઉપયોગ થાય છે. આવી એક યુક્તિમાં, કેન્દ્રિય કન્ડેન્સર પરથી પદાર્થ પર પડતા પ્રકાશને ડિસ્ક દ્વારા અવરોધવામાં આવે છે અને પદાર્થનું પ્રકાશન ત્રાંસા પ્રકાશ કિરણ દ્વારા કરવામાં આવે છે, જે સ્લાઇડ પરથી પરાવર્તિત થાય છે અને છબી ઘેરા પૃષ્ઠભૂમિ સામે પ્રકાશિત થાય છે. તેથી, આવા સૂક્ષ્મદર્શનને ડાર્ક ફીલ્ડ સૂક્ષ્મદર્શન તરીકે ઓળખવામાં આવે છે. માઇટોકોન્ડ્રિયા, કેન્દ્રકો, રસધાનીઓ, વગેરે, આનો ઉપયોગ કરીને સરળતાથી શોધી શકાય છે. તે જ રીતે, ફેઝ કોન્ટ્રાસ્ટ સૂક્ષ્મદર્શન નામના વિવિધ સ્વરૂપમાં, પારદર્શક પદાર્થમાંથી પસાર થતા પ્રકાશની તરંગ કંપનવિસ્તાર અને ફેઝ બદલાય છે. આ ફેરફાર પદાર્થ અથવા નમૂનાના ભાગની ઘનતા પર આધારિત છે. આવો ફેરફાર તે વિસ્તારમાં વધુ હોય છે જ્યાં ઘનતા તુલનાત્મક રીતે વધુ હોય છે અને જેના પરિણામે, પદાર્થના વિવિધ પ્રદેશોના વિવિધ કોન્ટ્રાસ્ટ જોઈ શકાય છે. આ ખાસ કરીને કોષ અંગિકાઓ અને ક્રોમોસોમના અભ્યાસમાં મદદરૂપ છે. કેટલાક વિશિષ્ટ રંગ સાથે પદાર્થ અથવા નમૂનાને રંગવાનું નિયમિતપણે કરવામાં આવે છે. કેટલાક વિશિષ્ટ પ્રકારના રંગો છે જેમ કે, એક્રિડિન ઓરેન્જ, બિસબેન્ઝિમાઇડ, મેરોસાયનિન (ફ્લોરોફોર્સ પણ કહેવાય છે). આ રંગો પ્રકાશિત થયા પછી લાંબી તરંગલંબાઈનો પ્રકાશ ઉત્સર્જિત કરવાની ક્ષમતા ધરાવે છે, જેને ફ્લોરોસન્સ કહેવાય છે. આના પરિણામે, ફ્લોરોફોર રંગેલો પદાર્થ વધુ પ્રકાશિત અને વપરાયેલા રંગના આધારે અલગ રંગનો દેખાય છે. ફ્લોરોસન્સ સૂક્ષ્મદર્શનમાં, તે જ સિદ્ધાંત લાગુ પડે છે. જોવાનો પદાર્થ અંગિકા અથવા અણુના ચોક્કસ ભાગનો અભ્યાસ કરવા માટે ફ્લોરોફોર સાથે રંગવામાં આવે છે. ફ્લોરોસન્સ સૂક્ષ્મદર્શક હેઠળ પદાર્થને પ્રકાશિત કર્યા પછી, ચોક્કસ રીતે રંગેલો પ્રદેશ સરળતાથી જોઈ શકાય છે અથવા અવલોકન કરી શકાય છે. આ ચેપ અને રોગપ્રતિકારક નિદાનનું કારણ જાણવા માટે બેક્ટેરિયા અથવા વાઈરસને ઓળખવામાં મદદરૂપ છે.

ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શન એ એક અત્યંત અદ્યતન તકનીક છે જેમાં અભ્યાસ કરવાના પદાર્થ પર ઇલેક્ટ્રોન બીમનો સ્ફોટ કરવામાં આવે છે જે દૃશ્યમાન પ્રકાશ કરતાં તરંગલંબાઈમાં લગભગ $1,00,000$ ગણી ટૂંકી હોય છે. ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શકમાં ઇલેક્ટ્રોન બીમ ઇલેક્ટ્રોમેગ્નેટિક લેન્સની મદદથી છબીને મોટી કરે છે. ઇલેક્ટ્રોનનો સંપૂર્ણ માર્ગ નિર્વાતમાં હોય છે અને જનરેટ થયેલી છબી ફ્લોરોસન્ટ સ્ક્રીન પર જોવામાં આવે છે અને આઈપીસ દ્વારા નહીં. ઇલેક્ટ્રોનની ખૂબ જ ટૂંકી તરંગલંબાઈને કારણે, ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શક દ્વારા ઉત્પન્ન થયેલી છબી ખૂબ જ ઉચ્ચ રિઝોલ્યુશનની હોય છે. બે પ્રકારના ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શનનો ઉપયોગ થાય છે; ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શન અને સ્કેનિંગ ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શન. ટ્રાન્સમિશન ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શનમાં, પદાર્થ અથવા નમૂનાનો અલ્ટ્રા-પાતળો ભારે ધાતુનું મીઠું (લીડ, ટંગસ્ટન, વગેરે) લેપિત વિભાગ એવી રીતે મૂકવામાં આવે છે કે ઇલેક્ટ્રોન બીમ તેમાંથી પસાર થઈને છબી બનાવે. ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શનની બીજી તકનીકમાં, પદાર્થની સોના અથવા પ્લેટિનમ લેપિત સપાટી પરથી પરાવર્તિત ઇલેક્ટ્રોન બીમ છબી બનાવે છે. આ તકનીકમાં, પદાર્થની સપાટીની ખૂબ વિસ્તૃત અને વિભેદિત છબી જનરેટ થાય છે, તેથી, તેને સ્કેનિંગ ઇલેક્ટ્રોન સૂક્ષ્મદર્શન કહેવામાં આવે છે.

છેલ્લા બે ત્રણ દાયકાઓમાં, હજુ એક વધુ અદ્યતન સૂક્ષ્મદર્શન ઇમેજિંગ તકનીક વિકસાવવામાં આવી છે અને ઉપયોગમાં લેવાય છે જેને કોન્ફોકલ સૂક્ષ્મદર્શન કહેવામાં આવે છે. કોન્ફોકલ સૂક્ષ્મદર્શન નિશ્ચિત કોષો/ઊતકોની અંદરની વિગતવાર રચનાઓને વિભેદિત કરવામાં ઉપયોગી છે અને પદાર્થોની તીક્ષ્ણ છબીઓ આપે છે. કોન્ફોકલ સૂક્ષ્મદર્શનનો ઉપયોગ કરીને પદાર્થની તપાસ કરવા માટે, તેને પ્રથમ ફ્લોરોસન્ટલી લેબલ કરવામાં આવે છે અને પછી ઉચ્ચ રિઝોલ્યુશનમાં કોન્ફોકલ સૂક્ષ્મદર્શક હેઠળ વિશ્લેષણ કરવામાં આવે છે.

12.2 કેન્દ્રત્યાગણ

તમે બધા જીવંત જીવોના કોષોમાં હાજર પ્રોટીન, ન્યુક્લિક એસિડ, વગેરે જેવા વિવિધ જૈવઅણુઓ વિશે અભ્યાસ કર્યો છે. આ જૈવઅણુઓનો અભ્યાસ કરવા માટે, તમારે એક અથવા બીજી અલગીકરણ તકનીકોનો ઉપયોગ કરીને તેમને અલગ કરવાની જરૂર છે. કેન્દ્રત્યાગણ એ એક એવી તકનીક છે જેમાં કણો અથવા અણુઓને તેમની ઘનતાના આધારે ગુરુત્વાકર્ષણ બળ (g) ની અસર હેઠળ, કેન્દ્રત્યાગી બળનો ઉપયોગ કરીને ઉચ્ચ ગતિએ અક્ષની આસપાસ દ્રાવણમાં ફેરવીને અલગ કરવામાં આવે છે. ઉપયોગમાં લેવાતા સાધનને સેન્ટ્રીફ્યુજ કહેવામાં આવે છે (ફિગ. 12.3), જે તેના ઉપયોગના આધારે વિવિધ પ્રકારનું હોય છે. તેમાં એક આધાર, એક ફરતું કન્ટેનર (સ્પિનિંગ વેસલ/રોટર) અને એક ઢાંકણ હોય છે.

ફિગ. 12.3: સેન્ટ્રીફ્યુજની મૂળભૂત રચના

સ્પિનિંગ વેસલમાં કેટલાક સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબ હોય છે. કોષ અર્ક અથવા મિશ્રણ સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં લેવામાં આવે છે અને ઇચ્છિત ગતિએ (પ્રતિ મિનિટ ક્રાંતિ; rpm) નિશ્ચિત સમયગાળા માટે ફેરવવાની મંજૂરી આપવામાં આવે છે જેના પરિણામે સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબના તળિયે કણાત્મક સામગ્રીનો સ્થાપન થાય છે.

12.2.1 અવસાદનના મૂળભૂત સિદ્ધાંતો

અવસાદન એ નિલંબનમાં રહેલા કણોની તે પ્રવાહીમાંથી બહાર નીકળીને વિશ્રામ લેવાની અને અવરોધ સામે આવી જવાની પ્રવૃત્તિ છે. આ તેમના પર કાર્ય કરતા બળોના જવાબમાં પ્રવાહીમાંથી તેમની ગતિને કારણે છે. આ બળો ગુરુત્વાકર્ષણ અને કેન્દ્રત્યાગી બળોને કારણે હોઈ શકે છે.

12.2.2 સેન્ટ્રીફ્યુજના પ્રકારો

વિવિધ પ્રકારના સેન્ટ્રીફ્યુજ વ્યાપારીક રીતે ઉપલબ્ધ છે. સંશોધન હેતુઓ માટે સામાન્ય રીતે ઉપયોગમાં લેવાતા સેન્ટ્રીફ્યુજ છે:

• ટેબલ ટોપ/ક્લિનિકલ સેન્ટ્રીફ્યુજ અથવા માઇક્રોફ્યુજ
• હાઈ-સ્પીડ સેન્ટ્રીફ્યુજ
• અલ્ટ્રાસેન્ટ્રીફ્યુજ
• ડિફરેન્શિયલ સેન્ટ્રીફ્યુજ

મોટી ક્ષમતાવાળા પ્રિપરેટિવ સેન્ટ્રીફ્યુજ, હાઈ સ્પીડ રેફ્રિજરેટેડ સેન્ટ્રીફ્યુજ અને અલ્ટ્રાસેન્ટ્રીફ્યુજ સેન્ટ્રીફ્યુજના મુખ્ય પ્રકારો છે.

સિદ્ધાંત અને એપ્લિકેશનના આધારે, નીચેના પ્રકારના કેન્દ્રત્યાગણ કરવામાં આવે છે-

ડિફરેન્શિયલ સેન્ટ્રીફ્યુગેશન- તે વિવિધ કદ અને ઘનતાના કણોના અવસાદન દર (કેન્દ્રત્યાગી બળ) માં તફાવત પર આધારિત છે. તેનો ઉપયોગ મોટી સેલ્યુલર રચનાઓ, ન્યુક્લિયર અપૂર્ણાંક, માઇટોકોન્ડ્રિયા, ક્લોરોપ્લાસ્ટ અથવા મોટા પ્રોટીનને અલગ કરવા માટે થાય છે.

ઘનતા-ઢાળ કેન્દ્રત્યાગણ- સમાન કદ પરંતુ ઘનતામાં ભિન્નતા ધરાવતા જૈવિક કણોને અલગ કરવા માટે, કોઈ ઘનતા ઢાળ કેન્દ્રત્યાગણનો ઉપયોગ કરી શકે છે. આ પ્રકારના કેન્દ્રત્યાગણમાં, સેન્ટ્રીફ્યુજ ટ્યુબમાં ઘનતા ઢાળ વિકસિત કરવામાં આવે છે. તેમની ઘનતાના આધારે, વિવિધ અણુઓ વિવિધ સ્તરોએ અવસાદિત થાય છે. ભારે અણુઓ બહારની તરફ જાય છે અને હલકા અણુઓ સેન્ટ્રીફ