अध्याय 11 जैव प्रौद्योगिकी: सिद्धांत और प्रक्रियाएँ

जैवप्रौद्योगिकी जीवित जीवों या जीवों से प्राप्त एंजाइमों का उपयोग करके ऐसे उत्पादों और प्रक्रियाओं को बनाने की तकनीकों से संबंधित है जो मनुष्यों के लिए उपयोगी हैं। इस अर्थ में, दही, रोटी या शराब बनाना—जो सभी सूक्ष्मजीव-आधारित प्रक्रियाएं हैं—को भी जैवप्रौद्योगिकी का एक रूप माना जा सकता है। हालांकि, आज इसका प्रयोग सीमित अर्थ में किया जाता है, जिससे ऐसी प्रक्रियाओं की ओर संकेत मिलता है जो आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों का उपयोग करके बड़े पैमाने पर यही कार्य करती हैं। इसके अतिरिक्त, कई अन्य प्रक्रियाओं/तकनीकों को भी जैवप्रौद्योगिकी के अंतर्गत शामिल किया गया है। उदाहरण के लिए, इन विट्रो निषेचन जिससे ‘टेस्ट-ट्यूब’ बच्चा पैदा होता है, एक जीन का संश्लेषण और उसका उपयोग, डीएनए वैक्सीन विकसित करना या एक दोषपूर्ण जीन को सुधारना—ये सभी जैवप्रौद्योगिकी का हिस्सा हैं।

यूरोपीय जैवप्रौद्योगिकी संघ (EFB) ने जैवप्रौद्योगिकी की एक ऐसी परिभाषा दी है जो पारंपरिक दृष्टिकोण और आधुनिक आणविक जैवप्रौद्योगिकी दोनों को समाहित करती है। EFB द्वारा दी गई परिभाषा इस प्रकार है: ‘प्राकृतिक विज्ञान और जीवों, कोशिकाओं, उनके अंशों और अणुगत समानार्थकों का उत्पादों और सेवाओं के लिए समन्वय’।

11.1 जैवप्रौद्योगिकी के सिद्धांत#

कई में से, वे दो मुख्य तकनीकें जिन्होंने आधुनिक जैवप्रौद्योगिकी के जन्म को सक्षम बनाया, ये हैं:

(i) आनुवंशिक अभियांत्रिकी : आनुवंशिक पदार्थ (DNA और RNA) की रसायनिक संरचना को बदलने की तकनीकें, इन्हें मेजबान जीवों में पेश करना और इस प्रकार मेजबान जीव की फ़नोटाइप को बदलना।

(ii) जैव-प्रक्रम अभियांत्रिकी : रासायनिक अभियांत्रिकी प्रक्रमों में स्टेराइल (सूक्ष्मजीव-संदूषण-रहित) वातावरण बनाए रखना ताकि केवल वांछित सूक्ष्मजीव/यूकैरियोटिक कोशिका का बड़े पैमाने पर विकास संभव हो सके और जैव-प्रौद्योगिकीय उत्पादों—जैसे एंटीबायोटिक्स, टीके, एंजाइम आदि—का उत्पादन किया जा सके।

आइए अब हम जेनेटिक इंजीनियरिंग के सिद्धांतों की वैचारिक उन्नति को समझें। आपने सम्भवतः लैंगिक प्रजनन की अलैंगिक प्रजनन पर बढ़त को समझा है। पहला विविधताओं के अवसर प्रदान करता है और जेनेटिक संरचना के अद्वितीय संयोजनों के निर्माण की अनुमति देता है, जिनमें से कुछ संयोजन जीव और समष्टि दोनों के लिए लाभकारी हो सकते हैं। अलैंगिक प्रजनन जेनेटिक सूचना को संरक्षित रखता है, जबकि लैंगिक प्रजनन विविधता की अनुमति देता है। पारंपरिक संकरण प्रक्रियाएँ, जो पौधों और पशुओं की प्रजनन में प्रयुक्त होती हैं, प्रायः अवांछित जीनों को वांछित जीनों के साथ सम्मिलित और गुणित कर देती हैं। जेनेटिक इंजीनियरिंग की तकनीकें—जिनमें पुनः-संयोजी डीएनए का निर्माण, जीन क्लोनिंग और जीन स्थानांतरण का प्रयोग शामिल है—इस सीमा को पार करती हैं और हमें केवल एक या एक समूह के वांछित जीनों को अलग करके लक्ष्य जीव में प्रवेश कराने की अनुमति देती हैं, बिना कोई अवांछित जीन लाए।

क्या आप जानते हैं कि किसी विदेशी जीव में किसी तरह स्थानांतरित हुए डीएनए के टुकड़े का संभावित भविष्य क्या होता है? सबसे अधिक संभावना है कि यह डीएनए का टुकड़ा जीव की संतति कोशिकाओं में स्वयं को प्रतिकृत करने में असमर्थ रहेगा। लेकिन, जब यह ग्राही के जीनोम में समेकित हो जाता है, तो यह प्रतिकृत हो सकता है और मेजबान डीएनए के साथ वंशानुगत हो सकता है। ऐसा इसलिए है क्योंकि विदेशी डीएनए का टुकड़ा एक गुणसूत्र का हिस्सा बन गया है, जिसमें प्रतिकृत होने की क्षमता होती है। एक गुणसूत्र में प्रतिकृतन प्रारंभ करने के लिए उत्तरदायी एक विशिष्ट डीएनए अनुक्रम होता है जिसे प्रतिकृतन का उद्गम कहा जाता है। इसलिए, किसी भी विदेशी डीएनए के टुकड़े के किसी जीव में गुणन के लिए यह आवश्यक है कि वह एक या अधिक गुणसूत्रों का हिस्सा बन जाए जिसमें ‘प्रतिकृतन का उद्गम’ नामक विशिष्ट अनुक्रम हो। इस प्रकार, एक विदेशी डीएनए को प्रतिकृतन के उद्गम से जोड़ा जाता है, ताकि यह विदेशी डीएनए का टुकड़ा मेजबान जीव में प्रतिकृत हो सके और स्वयं को गुणा कर सके। इसे क्लोनिंग या किसी भी टेम्पलेट डीएनए की कई समान प्रतियां बनाना भी कहा जा सकता है।

अब आइए पहली बार किसी कृत्रिम पुनर्संयोजी डीएनए अणु के निर्माण पर ध्यान दें। पहले पुनर्संयोजी डीएनए का निर्माण इस संभावना से उभरा कि एक जीन जो प्रतिजैविक प्रतिरोध को कूटबद्ध करता है, उसे साल्मोनेला टाइफीम्यूरियम के मूल प्लाज्मिड (स्वतः प्रतिकृतिकारी वृत्ताकार गुणसूत्र-बाह्य डीएनए) से जोड़ा जा सके। स्टैनली कोहेन और हर्बर्ट बॉयर ने 1972 में यह कार्य इस प्रकार किया कि उन्होंने एक प्लाज्मिड से प्रतिजैविक प्रतिरोध देने वाले डीएनए के टुकड़े को काटकर प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन को पृथक किया। डीएनए को विशिष्ट स्थानों पर काटना तथाकथित ‘आणविक कैंची’– प्रतिबंधन एंजाइमों की खोज से संभव हुआ। काटे गए डीएनए टुकड़े को फिर प्लाज्मिड डीएनए से जोड़ा गया। ये प्लाज्मिड डीएनए उस डीएनए टुकड़े को स्थानांतरित करने के लिए वेक्टर के रूप में कार्य करते हैं जो उससे जुड़ा होता है। आप शायद जानते हैं कि मच्छर मलेरिया परजीवी को मानव शरीर में स्थानांतरित करने वाला कीट वेक्टर है। उसी प्रकार, एक प्लाज्मिड को वेक्टर के रूप में प्रयोग कर किसी विदेशी डीएनए टुकड़े को मेजबान जीव में पहुँचाया जा सकता है। प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन को प्लाज्मिड वेक्टर से जोड़ना डीएनए लाइगेज नामक एंजाइम से संभव हुआ, जो कटे हुए डीएनए अणुओं पर कार्य करता है और उनके सिरों को जोड़ता है। इससे एक नया संयोजन वृत्ताकार स्वतः प्रतिकृतिकारी डीएनए इन विट्रो बनता है जिसे पुनर्संयोजी डीएनए कहा जाता है। जब इस डीएनए को एस्चेरिचिया कोलाई में स्थानांतरित किया गया, जो साल्मोनेला से निकटतः संबंधित एक जीवाणु है, तो वह नए मेजबान के डीएनए पॉलिमरेज़ एंजाइम का उपयोग कर प्रतिकृतियाँ बना सका। ई. कोलाई में प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन की प्रतियों को बढ़ाने की इस क्षमता को ई. कोलाई में प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन का क्लोनिंग कहा गया।

इससे आप यह निष्कर्ष निकाल सकते हैं कि किसी जीव को आनुवंशिक रूप से संशोधित करने में तीन मूलभूत चरण होते हैं —

(i) वांछनीय जीनों वाले डीएनए की पहचान;

(ii) पहचाने गए डीएनए को मेज़बान में प्रवेश कराना;

(iii) मेज़बान में प्रवेश कराए गए डीएनए को बनाए रखना और उस डीएनए को उसकी संतति में स्थानांतरित करना।

11.2 पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी के उपकरण#

अब हम उपरोक्त चर्चा से जान चुके हैं कि आनुवंशिक अभियांत्रिकी या पुनः संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी तभी संभव है जब हमारे पास प्रमुख उपकरण हों, अर्थात् प्रतिबंधक एंजाइम, पॉलिमरेज़ एंजाइम, लाइगेस, वेक्टर और मेज़बान जीव। आइए इनमें से कुछ को विस्तार से समझने का प्रयास करें।

11.2.1 प्रतिबंधक एंजाइम#

वर्ष 1963 में, एस्चेरिचिया कोलाई में बैक्टीरियोफ़ेज की वृद्धि को रोकने वाले दो एंजाइमों को पृथक किया गया। इनमें से एक डीएनए में मेथिल समूह जोड़ता था, जबकि दूसरा डीएनए को काटता था। बाद वाले को प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएस कहा गया।

पहला प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएस–Hind II, जिसका कार्य एक विशिष्ट डीएनए न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम पर निर्भर करता था, को पाँच वर्ष बाद पृथक और वर्णित किया गया। यह पाया गया कि Hind II हमेशा डीएनए अणुओं को एक विशिष्ट बिंदु पर काटता है, छह आधार युग्मों की एक विशिष्ट अनुक्रम को पहचान कर। इस विशिष्ट आधार अनुक्रम को Hind II की पहचान अनुक्रम के रूप में जाना जाता है। Hind II के अतिरिक्त, आज हम 900 से अधिक प्रतिबंधक एंजाइमों को जानते हैं जो 230 से अधिक जीवाणु उपभेदों से पृथक किए गए हैं और प्रत्येक भिन्न-भिन्न पहचान अनुक्रमों को पहचानते हैं।

इन एंजाइमों के नामकरण की परंपरा यह है कि नाम का पहला अक्षर जीनस से आता है और अगले दो अक्षर प्रोकैरियोटिक कोशिका की प्रजाति से आते हैं जिससे उन्हें पृथक किया गया था, उदाहरण के लिए, EcoRI Escherichia coli RY 13 से आया है। EcoRI में, अक्षर ‘R’ स्ट्रेन के नाम से लिया गया है। नामों के बाद आने वाले रोमन अंक उस बैक्टीरिया के स्ट्रेन से पृथक किए गए एंजाइमों के क्रम को दर्शाते हैं।

प्रतिबंधक एंजाइम न्यूक्लिएसेज़ नामक एंजाइमों की एक बड़ी श्रेणी से संबंधित हैं। ये दो प्रकार के होते हैं; एक्सोन्यूक्लिएसेज़ और एंडोन्यूक्लिएसेज़। एक्सोन्यूक्लिएसेज़ DNA के सिरों से न्यूक्लियोटाइड्स को हटाते हैं जबकि एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA के भीतर विशिष्ट स्थानों पर कट लगाते हैं।

प्रत्येक प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA अनुक्रम की लंबाई की ‘जांच’ करके कार्य करता है। एक बार यह अपना विशिष्ट पहचान अनुक्रम ढूंढ लेता है, यह DNA से बंध जाएगा और डबल हेलिक्स की दोनों स्ट्रैंडों को उनके शर्करा-फॉस्फेट बैकबोन में विशिष्ट बिंदुओं पर काट देगा (चित्र 11.1)। प्रत्येक प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ DNA में एक विशिष्ट पैलिंड्रोमिक न्यूक्लियोटाइड अनुक्रम को पहचानता है।

चित्र 11.1 प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ एंजाइम - EcoRI की क्रिया द्वारा पुनः संयोजक DNA के निर्माण के चरण

क्या आप जानते हैं कि पैलिन्ड्रोम क्या होते हैं? ये अक्षरों के ऐसे समूह होते हैं जिन्हें आगे और पीछे दोनों दिशाओं में पढ़ने पर एक ही शब्द बनता है, जैसे “MALAYALAM”। जहाँ एक शब्द-पैलिन्ड्रोम में एक ही शब्द दोनों दिशाओं में पढ़ा जाता है, वहीं डीएनए में पैलिन्ड्रोम आधार युग्मों (base pairs) का एक क्रम होता है जो दोनों स्ट्रैंड्स पर समान रूप से पढ़ा जाता है जब पढ़ने की दिशा एक समान रखी जाती है। उदाहरण के लिए, निम्नलिखित क्रम 5’ → 3’ दिशा में दोनों स्ट्रैंड्स पर समान रूप से पढ़ा जाता है। यह 3’ → 5’ दिशा में भी सत्य है।

$ \begin{aligned} 5^{\prime}—– \text { GAATTC }—– 3^{\prime} \\ 3^{\prime}—–\text { CTTAAG }—–5^{\prime} \end{aligned} $

प्रतिबंधक एंजाइम डीएनए के स्ट्रैंड को पैलिन्ड्रोम स्थलों के केंद्र से थोड़ा दूर काटते हैं, लेकिन विपरीत स्ट्रैंडों पर एक ही दो आधारों के बीच। इससे सिरों पर एकल स्ट्रैंड वाले हिस्से बच जाते हैं। प्रत्येक स्ट्रैंड पर ओवरहैंगिंग हिस्से होते हैं जिन्हें स्टिकी सिरे (sticky ends) कहा जाता है (चित्र 11.1)। इन्हें इसलिए ऐसा नाम दिया गया है क्योंकि ये अपने पूरक काटे गए समकक्षों के साथ हाइड्रोजन बंध बनाते हैं। सिरों की यह चिपचिपाहट एंजाइम डीएनए लाइगेज की क्रिया को सुविधाजनक बनाती है।

प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ जेनेटिक इंजीनियरिंग में ‘पुनःसंयोजक’ डीएनए अणुओं को बनाने के लिए प्रयुक्त होते हैं, जो विभिन्न स्रोतों/जीनोमों से प्राप्त डीएनए से बने होते हैं।

जब एक ही प्रतिबंधक एंजाइम द्वारा काटा जाता है, तो परिणामी डीएनए खंडों में एक ही प्रकार के ‘स्टिकी-सिरे’ होते हैं, और इन्हें डीएनए लाइगेज़ का उपयोग करके (सिरे-से-सिरे) जोड़ा जा सकता है (चित्र 11.2)।

चित्र 11.2 पुनःसंयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी की आरेखीय प्रस्तुति

आपने समझ लिया होगा कि सामान्यतः, जब तक वेक्टर और स्रोत डीएनए को एक ही प्रतिबंधन एंजाइम से नहीं काटा जाता, पुनःसंयोजक वेक्टर अणु नहीं बनाया जा सकता।

डीएनए खंडों का पृथक्करण और पृथकीकरण : प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएसेज द्वारा डीएनए के काटने से डीएनए के खंड प्राप्त होते हैं। इन खंडों को जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस नामक तकनीक द्वारा पृथक किया जा सकता है। चूँकि डीएनए खंड ऋणात्मक आवेशित अणु होते हैं, उन्हें एक विद्युत क्षेत्र के तहत एक माध्यम/मैट्रिक्स के माध्यम से धनाग्र (एनोड) की ओर बढ़ने के लिए विवश करके पृथक किया जा सकता है। आजकल सबसे अधिक प्रयुक्त मैट्रिक्स एगारोज है जो समुद्री शैवालों से निकाला गया एक प्राकृतिक बहुलक है। डीएनए खंड अपने आकार के अनुसार एगारोज जेल द्वारा प्रदत्त छलनी प्रभाव के माध्यम से पृथक (समाधानित) होते हैं। इसलिए, जितना छोटा खंड का आकार होता है, वह उतना अधिक दूर तक जाता है। चित्र 11.3 को देखें और अनुमान लगाएँ कि जेल के किस सिरे पर नमूना लोड किया गया था।

चित्र 11.3 एक विशिष्ट एगारोज जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस जो अपचयित (लेन 1) और पचयित डीएनए खंडों के समूह (लेन 2 से 4) के स्थानांतरण को दर्शाता है

पृथक किए गए डीएनए खंडों को केवल एथिडियम ब्रोमाइड नामक यौगिक से डीएनए को स्टेन करने और तत्पश्चात यूवी विकिरण के संपर्क में लाने के बाद ही देखा जा सकता है (आप शुद्ध डीएनए खंडों को दृश्य प्रकाश में और बिना स्टेनिंग के नहीं देख सकते)। आप यूवी प्रकाश के संपर्क में आई एथिडियम ब्रोमाइड से स्टेन की गई जेल में डीएनए की चमकदार नारंगी रंग की पट्टियाँ देख सकते हैं (चित्र 11.3)। डीएनए की पृथक की गई पट्टियों को एगारोज जेल से काटकर जेल टुकड़े से निकाला जाता है। इस चरण को एल्यूशन कहा जाता है। इस प्रकार शुद्ध किए गए डीएनए खंडों का उपयोग क्लोनिंग वेक्टरों के साथ जोड़कर पुनः संयोजी डीएनए बनाने में किया जाता है।

11.2.2 क्लोनिंग वेक्टर#

आप जानते हैं कि प्लाज्मिड और बैक्टीरियोफेज में क्रोमोसोमल डीएनए के नियंत्रण से स्वतंत्र रूप से बैक्टीरियल कोशिकाओं के भीतर प्रतिकृतिकरण करने की क्षमता होती है। बैक्टीरियोफेज, प्रति कोशिका उनकी उच्च संख्या के कारण, बैक्टीरियल कोशिकाओं के भीतर अपने जीनोम की बहुत उच्च प्रतिलिपि संख्या रखते हैं। कुछ प्लाज्मिडों की प्रति कोशिका केवल एक या दो प्रतिलिपियाँ हो सकती हैं जबकि अन्य की 15-100 प्रतिलिपियाँ हो सकती हैं। उनकी संख्या और भी अधिक हो सकती है। यदि हम किसी विदेशी डीएनए खंड को बैक्टीरियोफेज या प्लाज्मिड डीएनए से जोड़ने में सक्षम होते हैं, तो हम उसकी संख्या को प्लाज्मिड या बैक्टीरियोफेज की प्रतिलिपि संख्या के बराबर गुणा कर सकते हैं। वर्तमान में प्रयुक्त वेक्टर इस प्रकार इंजीनियर किए गए हैं कि वे विदेशी डीएनए को आसानी से जोड़ने और पुनः संयोजी को अ-पुनः संयोजी से चयनित करने में सहायता करते हैं।

निम्नलिखित ऐसी विशेषताएँ हैं जो किसी वेक्टर में क्लोनिंग को सुगम बनाने के लिए आवश्यक होती हैं।

(i) रेप्लिकेशन का उद्गम (ori) : यह एक अनुक्रम है जहाँ से प्रतिकृत्ति प्रारंभ होती है और कोई भी DNA खंड जब इस अनुक्रम से जुड़ा जाता है, तो वह मेज़बान कोशिकाओं के भीतर प्रतिकृत्त हो सकता है। यह अनुक्रम जुड़े हुए DNA की प्रति संख्या को नियंत्रित करने के लिए भी उत्तरदायी है। इसलिए, यदि किसी को लक्ष्य DNA की अनेक प्रतियाँ प्राप्त करनी हैं, तो उसे एक ऐसे वेक्टर में क्लोन करना चाहिए जिसका उद्गम उच्च प्रति संख्या का समर्थन करता हो।

(ii) चयन योग्य चिह्न : ‘ori’ के अतिरिक्त, वेक्टर को एक चयन योग्य चिह्न की आवश्यकता होती है, जो गैर-रूपांतरितों की पहचान और उन्मूलन में सहायता करता है और रूपांतरितों के विकास को चयनात्मक रूप से अनुमति देता है। रूपांतरण एक प्रक्रिया है जिसके द्वारा कोई DNA खंड मेज़बान जीवाणु में प्रस्तुत किया जाता है (आप इस प्रक्रिया को आगामी खंड में पढ़ेंगे)। सामान्यतः, ऐसे जीन जो ऐम्पीसिलिन, क्लोरैम्फ़ेनिकॉल, टेट्रासाइक्लिन या कैनामाइसिन आदि प्रतिजैविकों के प्रति प्रतिरोध को कूटबद्ध करते हैं, E. coli के लिए उपयोगी चयन योग्य चिह्न माने जाते हैं। सामान्य E. coli कोशिकाएँ इनमें से किसी भी प्रतिजैविक के विरुद्ध प्रतिरोध नहीं रखती हैं।

आकृति 11.4 E. coli क्लोनिंग वेक्टर pBR322 जिसमें प्रतिबंधन स्थल (Hind III, EcoR I, BamH I, Sal I, Pvu II, Pst I, Cla I), ori और प्रतिजैविक प्रतिरोध जीन (ampR और tetR) दिखाए गए हैं। rop प्लाज़्मिड की प्रतिकृत्ति में संलग्न प्रोटीनों के लिए कूटबद्ध करता है।

(iii) क्लोनिंग स्थल: विदेशी DNA को जोड़ने के लिए, वेक्टर में बहुत कम, अधिमानतः एकल, पहचान स्थल होने चाहिए जो सामान्यतः प्रयुक्त प्रतिबंधन एंजाइमों के लिए हों। वेक्टर के भीतर एक से अधिक पहचान स्थलों की उपस्थिति कई खंड उत्पन्न करेगी, जो जीन क्लोनिंग को जटिल बना देगी (चित्र 11.4)। विदेशी DNA का लिगेशन उस प्रतिबंधन स्थल पर किया जाता है जो दो एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीनों में से एक में उपस्थित होता है। उदाहरण के लिए, आप विदेशी DNA को वेक्टर pBR322 के टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध जीन के BamH I स्थल पर लिगेट कर सकते हैं। पुनः संयोजी प्लाज्मिड विदेशी DNA के समावेश के कारण टेट्रासाइक्लिन प्रतिरोध खो देंगे, लेकिन इन्हें ट्रांसफॉर्मेंट्स को टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर प्लेटिंग करके गैर-पुनः संयोजी वालों से अलग किया जा सकता है। एम्पिसिलिन युक्त माध्यम पर बढ़ने वाले ट्रांसफॉर्मेंट्स को फिर टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर स्थानांतरित किया जाता है। पुनः संयोजी एम्पिसिलिन युक्त माध्यम पर बढ़ेंगे लेकिन टेट्रासाइक्लिन युक्त माध्यम पर नहीं। लेकिन, गैर-पुनः संयोजी दोनों एंटीबायोटिक्स युक्त माध्यम पर बढ़ेंगे। इस स्थिति में, एक एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन ट्रांसफॉर्मेंट्स का चयन करने में मदद करता है, जबकि दूसरा एंटीबायोटिक प्रतिरोध जीन विदेशी DNA के समावेश के कारण ‘निष्क्रिय हो जाता है’, और पुनः संयोजी का चयन करने में मदद करता है।
एंटीबायोटिक्स के निष्क्रिय होने के कारण पुनः संयोजी का चयन एक कठिन प्रक्रिया है क्योंकि इसके लिए दो अलग-अलग एंटीबायोटिक्स वाली प्लेटों पर एक साथ प्लेटिंग करनी पड़ती है। इसलिए, वैकल्पिक चयनात्मक मार्कर विकसित किए गए हैं जो क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में रंग उत्पन्न करने की क्षमता के आधार पर पुनः संयोजी को गैर-पुनः संयोजी से अलग करते हैं। इसमें, एक पुनः संयोजी DNA को एक एंजाइम, β-galactosidase, की कोडिंग अनुक्रम के भीतर सम्मिलित किया जाता है। इससे इस एंजाइम के संश्लेषण के लिए जीन निष्क्रिय हो जाता है, जिसे समावेशी निष्क्रियन कहा जाता है। क्रोमोजेनिक सब्सट्रेट की उपस्थिति में नीले रंग के कॉलोनी बनते हैं यदि बैक्टीरिया में प्लाज्मिड में कोई सम्मिलन नहीं है। सम्मिलन की उपस्थिति β-galactosidase जीन के समावेशी निष्क्रियन का कारण बनती है और कॉलोनी कोई रंग नहीं उत्पन्न करते, इन्हें पुनः संयोजी कॉलोनी के रूप में पहचाना जाता है।

(iv) पादपों और जानवरों में जीन क्लोनिंग के लिए सदिश : आप आश्चर्यचकित होंगे जानकर कि हमने जीनों को पादपों और जानवरों में स्थानांतरित करने की कला बैक्टीरिया और वायरसों से सीखी है, जो यह बात सदियों से जानते हैं — कि यूकैरियोटिक कोशिकाओं में जीन डिलीवर कर उन्हें रूपांतरित कैसे किया जाए और उन्हें वैसा करने के लिए मजबूर किया जाए जो बैक्टीरिया या वायरस चाहते हैं। उदाहरण के लिए, Agrobacterium tumifaciens, जो कई द्विबीजपत्री पादपों का रोगजनक है, सामान्य पादप कोशिकाओं को ट्यूमर में बदलने के लिए ‘T-DNA’ नामक एक DNA टुकड़ा डिलीवर करने में सक्षम है और इन ट्यूमर कोशिकाओं को रोगजनक द्वारा आवश्यक रसायन उत्पन्न करने का निर्देश देता है। इसी प्रकार, जानवरों में रेट्रोवायरस सामान्य कोशिकाओं को कैंसर कोशिकाओं में बदलने की क्षमता रखते हैं। यूकैरियोटिक मेज़बानों में रोगजनकों द्वारा जीन डिलीवर करने की कला को बेहतर ढंग से समझने से यह ज्ञान उत्पन्न हुआ है कि इन रोगजनकों के उपकरणों को मानव हित के लिए उपयोगी सदिशों में रूपांतरित किया जा सके। Agrobacterium tumifaciens के ट्यूमर उत्पन्न करने वाले (Ti) प्लाज़्मिड को अब एक क्लोनिंग सदिश में संशोधित किया गया है जो अब पादपों के लिए रोगजनक नहीं है लेकिन अभी भी हमारे इच्छित जीनों को विभिन्न पादपों में डिलीवर करने की क्रियाविधि का उपयोग करने में सक्षम है। इसी प्रकार, रेट्रोवायरसों को भी निष्क्रिय कर दिया गया है और अब इन्हें पशु कोशिकाओं में वांछनीय जीन डिलीवर करने के लिए प्रयोग किया जाता है। इसलिए, एक बार जब कोई जीन या DNA खंड उपयुक्त सदिश में लिगेट कर दिया जाता है, तो इसे बैक्टीरियल, पादप या पशु मेज़बान में स्थानांतरित किया जाता है (जहाँ यह गुणन करता है)।

11.2.3 सक्षम मेज़बान (पुनःसंयोजी DNA के साथ रूपांतरण के लिए)#

चूँकि DNA एक जलप्रेही अणु है, यह कोशिका झिल्ली से नहीं गुजर सकता। क्यों? बैक्टीरिया को प्लाज्मिड ग्रहण करने के लिए विवश करने हेतु, बैक्टीरियल कोशिकाओं को पहले DNA ग्रहण करने के लिए ‘सक्षम’ बनाना होता है। यह उन्हें कैल्शियम जैसे द्विसंयोजी धनायन की एक विशिष्ट सांद्रता के साथ उपचारित करके किया जाता है, जो DNA के उसके कोशिका भित्ति के छिद्रों से बैक्टीरियम में प्रवेश की दक्षता बढ़ाता है। फिर पुनःसंयोजी DNA को ऐसी कोशिकाओं में प्रवेश करने के लिए मजबूर किया जा सकता है—कोशिकाओं को बर्फ पर पुनःसंयोजी DNA के साथ इनक्यूबेट करना, फिर उन्हें संक्षेप में 42°C पर रखना (ऊष्मा आघात), और पुनः बर्फ पर वापस रखना। यह बैक्टीरिया को पुनःसंयोजी DNA ग्रहण करने में सक्षम बनाता है।

यह एकमात्र तरीका नहीं है विदेशी DNA को मेज़बान कोशिकाओं में पहुँचाने का। एक विधि, जिसे सूक्ष्म-इंजेक्शन कहा जाता है, में पुनःसंयोजी DNA को सीधे एक पशु कोशिका के केन्द्रक में इंजेक्ट किया जाता है। एक अन्य विधि, जो पौधों के लिए उपयुक्त है, में कोशिकाओं को उच्च वेग के सोने या टंगस्टन के सूक्ष्म कणों से बमबारी की जाती है, जो DNA से लेपित होते हैं; इसे बायोलिस्टिक्स या जीन गन विधि कहा जाता है। और अंतिम विधि ‘निष्क्रिय रोगजनक’ वेक्टरों का उपयोग करती है, जब इन्हें कोशिका को संक्रमित होने दिया जाता है, तो ये पुनःसंयोजी DNA को मेज़बान में स्थानांतरित कर देते हैं।

अब जब हमने पुनःसंयोजी DNA निर्माण के उपकरणों के बारे में सीख लिया है, तो आइए पुनःसंयोजी DNA प्रौद्योगिकी की सुविधा प्रदान करने वाली प्रक्रियाओं पर चर्चा करें।

11.3 पुनःसंयोजी DNA प्रौद्योगिकी की प्रक्रियाएँ#

पुनः संयोजी डीएनए प्रौद्योगिकी में डीएनए के पृथक्करण, प्रतिबंधक एंडोन्यूक्लिएसेज़ द्वारा डीएनए के खंडन, वांछित डीएनए खंड का पृथक्करण, डीएनए खंड को वेक्टर में लिगेशन, पुनः संयोजी डीएनए को होस्ट में स्थानांतरण, होस्ट कोशिकाओं को बड़े पैमाने पर माध्यम में संवर्धन और वांछित उत्पाद के निष्कर्षण जैसे कई चरण निश्चित क्रम में शामिल होते हैं। आइए इनमें से प्रत्येक चरण को कुछ विस्तार से देखें।

11.3.1 आनुवंशिक पदार्थ (डीएनए) का पृथक्करण#

याद कीजिए कि न्यूक्लिक अम्ल सभी जीवों का आनुवंशिक पदार्थ है बिना किसी अपवाद के। अधिकांश जीवों में यह डीऑक्सीराइबोन्यूक्लिक अम्ल या DNA होता है। DNA को प्रतिबंधक एंजाइमों द्वारा काटने के लिए, इसे शुद्ध रूप में होना चाहिए, अन्य बड़े अणुओं से मुक्त। चूंकि DNA झिल्लियों के भीतर बंद होता है, हमें कोशिका को खोलना पड़ता है ताकि DNA को RNA, प्रोटीन, पॉलीसैकेराइड और लिपिड्स जैसे अन्य बड़े अणुओं के साथ मुक्त किया जा सके। यह बैक्टीरियल कोशिकाओं/पादप या पशु ऊतकों को लाइसोजाइम (बैक्टीरिया), सेल्यूलेज (पादप कोशिकाएं), काइटिनेज (कवक) जैसे एंजाइमों के साथ उपचारित करके प्राप्त किया जा सकता है। आप जानते हैं कि जीन लंबे DNA अणुओं पर स्थित होते हैं जो हिस्टोन जैसे प्रोटीनों के साथ लिपटे होते हैं। RNA को राइबोन्यूक्लिएस के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है जबकि प्रोटीन को प्रोटिएस के साथ उपचारित करके हटाया जा सकता है। अन्य अणुओं को उपयुक्त उपचारों द्वारा हटाया जा सकता है और शुद्ध DNA अंततः ठंडे एथेनॉल की अतिरिक्ति के बाद अवक्षेपित हो जाता है। इसे निलंबन में बारीक धागों के समूह के रूप में देखा जा सकता है (चित्र 11.5)।

चित्र 11.5 DNA जो अलग होता है उसे स्पूलिंग द्वारा हटाया जा सकता है

11.3.2 विशिष्ट स्थानों पर DNA को काटना#

प्रतिबंधक एंजाइम पाचन को शुद्ध डीएनए अणुओं को उस विशिष्ट एंजाइम के लिए इष्टतम परिस्थितियों में प्रतिबंधक एंजाइम के साथ इनक्यूबेट करके किया जाता है। प्रतिबंधक एंजाइम पाचन की प्रगति की जांच करने के लिए एगारोस जेल इलेक्ट्रोफोरेसिस का उपयोग किया जाता है। डीएनए एक ऋणात्मक आवेशित अणु होता है, इसलिए यह धनात्मक इलेक्ट्रोड (ऐनोड) की ओर बढ़ता है (चित्र 11.3)। यह प्रक्रिया वेक्टर डीएनए के साथ भी दोहराई जाती है।

डीएनए की जोड़ने में कई प्रक्रियाएं शामिल होती हैं। स्रोत डीएनए और वेक्टर डीएनए दोनों को एक विशिष्ट प्रतिबंधक एंजाइम से काटने के बाद, स्रोत डीएनए से काटा गया ‘रुचि का जीन’ और जगह के साथ काटा गया वेक्टर मिलाया जाता है और लाइगेज जोड़ा जाता है। इससे पुनः संयोजन डीएनए की तैयारी होती है।

11.3.3 पीसीआर का उपयोग करके रुचि के जीन का प्रवर्धन#

पीसीआर का अर्थ है पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन। इस अभिक्रिया में, रुचि के जीन (या डीएनए) की कई प्रतियाँ इन विट्रो में दो प्राइमर सेटों (छोटे रासायनिक रूप से संश्लेषित ओलिगोन्यूक्लियोटाइड्स जो डीएनए के क्षेत्रों के पूरक होते हैं) और एंजाइम डीएनए पॉलिमरेज़ का उपयोग करके संश्लेषित की जाती हैं। एंजाइम प्रदान किए गए न्यूक्लियोटाइड्स और जीनोमिक डीएनए को टेम्पलेट के रूप में उपयोग करके प्राइमरों का विस्तार करता है। यदि डीएनए की प्रतिकृति की प्रक्रिया को कई बार दोहराया जाता है, तो डीएनए के खंड को लगभग एक अरब गुना तक प्रवर्धित किया जा सकता है, अर्थात् 1 अरब प्रतियाँ बनाई जाती हैं। ऐसा बार-बार प्रवर्धन थर्मोस्टेबल डीएनए पॉलिमरेज़ (एक जीवाणु, थर्मस एक्वाटिकस से पृथक) के उपयोग द्वारा प्राप्त किया जाता है, जो डबल स्ट्रैंडेड डीएनए के उच्च तापमान प्रेरित विकृतिकरण के दौरान सक्रिय रहता है। यदि वांछित हो तो प्रवर्धित खंड को अब वेक्टर के साथ लिगेट करने के लिए उपयोग किया जा सकता है ताकि आगे क्लोनिंग की जा सके (आकृति11.6)।

आकृति 11.6 पॉलिमरेज़ चेन रिएक्शन (पीसीआर): प्रत्येक चक्र में तीन चरण होते हैं: (i) विकृतिकरण; (ii) प्राइमर ऐनीलिंग; और (iii) प्राइमरों का विस्तार

11.3.4 पुनः संयोजी डीएनए को होस्ट कोशिका/जीव में सम्मिलन#

लिगेटेड डीएनए को रेसिपिएंट कोशिकाओं में पेश करने के कई तरीके होते हैं। रेसिपिएंट कोशिकाओं को प्राप्त करने के लिए ‘सक्षम’ बनाने के बाद, वे अपने आस-पास मौजूद डीएनए को ग्रहण कर लेती हैं। इसलिए, यदि किसी रिकॉम्बिनेंट डीएनए में किसी एंटीबायोटिक (जैसे ऐम्पिसिलिन) के प्रतिरोध के लिए जीन होता है, और उसे ई. कोलाई कोशिकाओं में स्थानांतरित किया जाता है, तो होस्ट कोशिकाएँ ऐम्पिसिलिन-प्रतिरोधी कोशिकाओं में रूपांतरित हो जाती हैं। यदि हम रूपांतरित कोशिकाओं को ऐम्पिसिलिन युक्त आगार प्लेटों पर फैलाएँ, तो केवल ट्रांसफॉर्मेंट ही बढ़ेंगे, अनरूपांतरित रेसिपिएंट कोशिकाएँ मर जाएंगी। चूंकि ऐम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन के कारण, ऐम्पिसिलिन की उपस्थिति में रूपांतरित कोशिका का चयन किया जा सकता है। इस मामले में ऐम्पिसिलिन प्रतिरोध जीन को चयन योग्य मार्कर कहा जाता है।

11.3.5 विदेशी जीन उत्पाद प्राप्त करना#

जब आप किसी क्लोनिंग वेक्टर में विदेशी डीएनए का एक टुकड़ा डालते हैं और उसे किसी जीवाणु, पौधे या पशु कोशिका में स्थानांतरित करते हैं, तो विदेशी डीएनए की प्रतिकृति होती है। लगभग सभी रिकॉम्बिनेंट तकनीकों में अंतिम उद्देश्य कोई वांछनीय प्रोटीन बनाना होता है। इसलिए, रिकॉम्बिनेंट डीएनए को व्यक्त होने की आवश्यकता होती है। विदेशी जीन उपयुक्त परिस्थितियों के तहत व्यक्त होता है। होस्ट कोशिकाओं में विदेशी जीनों की अभिव्यक्ति में कई तकनीकी विवरणों को समझना शामिल होता है।

जीन को क्लोन करने और लक्षित प्रोटीन के अभिव्यक्ति को प्रेरित करने की स्थितियों को अनुकूलित करने के बाद, इसे बड़े पैमाने पर उत्पादन करने पर विचार करना होता है। क्या आप सोच सकते हैं कि बड़े पैमाने पर उत्पादन की आवश्यकता क्यों है? यदि कोई प्रोटीन कोडिंग जीन विषमजाती होस्ट में व्यक्त होता है, तो इसे पुनःसंयोजक प्रोटीन कहा जाता है। रुचि के क्लोन किए गए जीनों को वहन करने वाली कोशिकाओं को प्रयोगशाला में छोटे पैमाने पर उगाया जा सकता है। संस्कृतियों का उपयोग वांछित प्रोटीन को निकालने और फिर विभिन्न पृथक्करण तकनीकों का उपयोग करके इसे शुद्ध करने के लिए किया जा सकता है।

कोशिकाओं को एक सतत संवर्धन प्रणाली में भी गुणा किया जा सकता है जिसमें उपयोग किया गया माध्यम एक ओर से निकाला जाता है जबकि ताजा माध्यम दूसरी ओर से जोड़ा जाता है ताकि कोशिकाओं को उनके शारीरिक रूप से सबसे सक्रिय लॉग/घातांकीय चरण में बनाए रखा जा सके। इस प्रकार की संवर्धन विधि अधिक जैव द्रव्य पैदा करती है जिससे वांछित प्रोटीन की उच्च उपज होती है।

छोटी मात्रा की संस्कृतियाँ उत्पादों की उल्लेखनीय मात्रा नहीं दे सकतीं। बड़ी मात्रा में उत्पादन करने के लिए, बायोरिएक्टरों का विकास आवश्यक था, जहाँ संस्कृति की बड़ी मात्राएँ (100-1000 लीटर) संसाधित की जा सकती हैं। इस प्रकार, बायोरिएक्टरों को ऐसे पात्रों के रूप में सोचा जा सकता है जिनमें कच्चे माल को जैविक रूप से विशिष्ट उत्पादों, व्यक्तिगत एंजाइमों आदि में परिवर्तित किया जाता है, जिसमें सूक्ष्मजीव, पौधे, पशु या मानव कोशिकाओं का उपयोग होता है। एक बायोरिएक्टर वांछित उत्पाद को प्राप्त करने के लिए इष्टतम विकास स्थितियाँ (तापमान, pH, सब्सट्रेट, लवण, विटामिन, ऑक्सीजन) प्रदान करके इष्टतम परिस्थितियाँ प्रदान करता है।

सबसे अधिक प्रयोग किए जाने वाले बायोरिएक्टर चलनी प्रकार के होते हैं, जिन्हें चित्र 11.7 में दिखाया गया है।

चित्र 11.7 (क) सरल चलनी-टैंक बायोरिएक्टर; (ख) स्पार्ज्ड चलनी-टैंक बायोरिएक्टर जिसके माध्यम से निर्जीव वायु बुलबुले स्पार्ज किए जाते हैं

एक चलनी-टैंक रिएक्टर आमतौर पर बेलनाकार होता है या इसका आधार वक्र होता है ताकि रिएक्टर की सामग्री को मिलाने में सुविधा हो। चलनी समान रूप से मिश्रण और पूरे बायोरिएक्टर में ऑक्सीजन की उपलब्धता सुनिश्चित करता है। वैकल्पिक रूप से वायु को रिएक्टर के माध्यम से बुलबुले बनाकर प्रवाहित किया जा सकता है। यदि आप चित्र को ध्यान से देखें तो आप देखेंगे कि बायोरिएक्टर में एक आंदोलन प्रणाली, एक ऑक्सीजन वितरण प्रणाली और एक फोम नियंत्रण प्रणाली, एक तापमान नियंत्रण प्रणाली, pH नियंत्रण प्रणाली और नमूना पोर्ट हैं ताकि संस्कृति के छोटे आयतनों को समय-समय पर निकाला जा सके।

11.3.6 डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग#

जैवसंश्लेषण चरण के पूरा होने के बाद, उत्पाद को तैयार उत्पाद के रूप में विपणन के लिए तैयार होने से पहले एक श्रृंखला की प्रक्रियाओं से गुजरना पड़ता है। इन प्रक्रियाओं में पृथक्करण और शुद्धिकरण शामिल हैं, जिन्हें सामूहिक रूप से डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग कहा जाता है। उत्पाद को उपयुक्त संरक्षक के साथ तैयार किया जाना चाहिए। ऐसे तैयार किए गए उत्पाद को दवाओं की तरह पूर्ण नैदानिक परीक्षणों से गुजरना पड़ता है। प्रत्येक उत्पाद के लिए सख्त गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण भी आवश्यक है। डाउनस्ट्रीम प्रोसेसिंग और गुणवत्ता नियंत्रण परीक्षण उत्पाद से उत्पाद तक भिन्न होते हैं।

सारांश#

जैवप्रौद्योगिकी जीवित जीवों, कोशिकाओं या एंजाइमों का उपयोग करके उत्पादों और प्रक्रियाओं के बड़े पैमाने पर उत्पादन और विपणन से संबंधित है। आनुवंशिक रूप से संशोधित जीवों का उपयोग करने वाली आधुनिक जैवप्रौद्योगिकी तभी संभव हो सकी जब मनुष्य ने डीएनए की रसायनिक संरचना को बदलना और पुनर्संयोजक डीएनए बनाना सीखा। इस प्रमुख प्रक्रिया को पुनर्संयोजक डीएनए प्रौद्योगिकी या आनुवंशिक इंजीनियरिंग कहा जाता है। इस प्रक्रिया में प्रतिबंधन एंडोन्यूक्लिएस, डीएनए लाइगेज, उपयुक्त प्लाज्मिड या वायरल वेक्टरों का उपयोग कर विदेशी डीएनए को मेजबान जीवों में पृथक करना और पहुंचाना, विदेशी जीन की अभिव्यक्ति, जीन उत्पाद अर्थात कार्यात्मक प्रोटीन की शुद्धि और अंत में विपणन के लिए उपयुक्त तैयारी शामिल है। बड़े पैमाने पर उत्पादन में बायोरिएक्टरों का उपयोग होता है।