12.1 సూక్ష్మదర్శిని

సూక్ష్మదర్శిని లేకుండా జీవశాస్త్ర అధ్యయనాలు మరియు పరిశోధనలను ఊహించలేము, ఎందుకంటే అది మన కళ్ళకు కనిపించని వాటిని చూడటానికి అవకాశం కల్పిస్తుంది. నేడు, సూక్ష్మదర్శిని పద్ధతి చాలా అభివృద్ధి చెందింది, ఒక పరిశోధకుడు చాలా సూక్ష్మమైన నిర్మాణం యొక్క అత్యంత వృద్ధి చేయబడిన చిత్రాన్ని మాత్రమే కాకుండా, అటువంటి వస్తువుల త్రిమితీయ నిర్మాణాన్ని కూడా దర్శించగలడు. శక్తివంతమైన ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శిని పద్ధతులను ఉపయోగించి, బ్యాక్టీరియా మరియు వైరస్ల DNA అణువు కూడా దర్శించబడింది.

మొదటి సూక్ష్మదర్శిని యొక్క ఉపయోగం 1665 సంవత్సరానికి చెందినది, బ్రిటిష్ భౌతిక శాస్త్రవేత్త రాబర్ట్ హుక్ వృద్ధి చేసే లెన్సుల కలయికను ఉపయోగించి ఒక సాధారణ సూక్ష్మదర్శినిని రూపొందించాడు (Fig. 12.1) మరియు కార్క్ ముక్కలను గమనించి, ఆ తేనెగూడు వంటి నిర్మాణానికి సెల్యులే లేదా సెల్ అనే పదాన్ని నాణెంగా ఉపయోగించాడు. మెత్తియాస్ జాకబ్ ష్లీడెన్ మరియు థియోడోర్ ష్వాన్ 1838లో మొక్కలు మరియు జంతువులలో కణాల గమనిక ఆధారంగా కణ సిద్ధాంతాన్ని ప్రతిపాదించారని మీకు తెలుసు.

Fig. 12.1: సూక్ష్మదర్శిని

12.1.1 వృద్ధి మరియు రిజల్యూషన్

సూక్ష్మదర్శిని పద్ధతి ఆధారపడిన సూత్రంపై ఇప్పుడు దృష్టి పెడదాం. సూక్ష్మదర్శిని వంటి ఒక దృశ్య పరికరానికి రెండు దృశ్య లక్షణాలు చాలా ముఖ్యమైనవి. ఒకటి వృద్ధి చేసే శక్తి మరియు మరొకటి వేరు చేసే సామర్థ్యం.

సూక్ష్మదర్శిని యొక్క వృద్ధి లేదా వృద్ధి చేసే శక్తి అనేది రెటీనా చిత్రం పరిమాణాన్ని పెంచగల సామర్థ్యం. కాబట్టి సరళంగా చెప్పాలంటే వృద్ధి అంటే -

సూక్ష్మదర్శిని సహాయంతో రెటీనా చిత్రం పరిమాణం / సూక్ష్మదర్శిని ఉపయోగించకుండా రెటీనా చిత్రం పరిమాణం

భౌతిక శాస్త్రంలో మీరు చదివి ఉండవచ్చు, ఒక లెన్స్ యొక్క వృద్ధి (M) క్రింది సూత్రాల ప్రకారం కొలుస్తారు (దీనిలో $f$ లెన్స్ యొక్క కేంద్రీయ దూరం మరియు $d$ లెన్స్ నుండి వస్తువు యొక్క దూరం).

$$ M=\frac{f}{f-d} $$

సాధారణంగా, ప్రయోగశాలలో ఉపయోగించే సూక్ష్మదర్శిని ఒక సంయుక్త సూక్ష్మదర్శిని, దీనిలో రెండు సెట్ల లెన్సులు ఉంటాయి. ఒకటి ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ అంటారు, ఇది చూడవలసిన వస్తువుకు దగ్గరగా ఉంటుంది, మరియు మరొకటి ఐపీస్, దీని ద్వారా పరిశీలకుడు చూస్తాడు. వస్తువు యొక్క వృద్ధి చేయబడిన చిత్రాన్ని చూడటానికి కాంతి ప్రయాణానికి, వస్తువు, ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్, ఐపీస్ మరియు పరిశీలకుడి కన్ను ఒకే రేఖలో ఉండాలని చెప్పనవసరం లేదు. సరళంగా చెప్పాలంటే, ఒక సూక్ష్మదర్శిని యొక్క వృద్ధి అనేది ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ యొక్క వృద్ధి శక్తి మరియు ఐపీస్ యొక్క వృద్ధి శక్తి యొక్క లబ్ధం $\left(\mathrm{M} _{\mathrm{o}} \times \mathrm{M} _{\mathrm{e}}\right)$.

రిజల్వింగ్ పవర్ అనేది సూక్ష్మదర్శిని యొక్క మరొక ముఖ్యమైన లక్షణం, ఇది ఒకదానికొకటి చాలా దగ్గరగా ఉన్న రెండు వస్తువుల వేర్వేరు చిత్రాలను ఏర్పరచే సామర్థ్యం. ఇది రెండు బిందువుల మధ్య అతి చిన్న దూరం ద్వారా కొలవబడుతుంది.

12.1.2 కాంతి సూక్ష్మదర్శిని యొక్క పనితీరు

మునుపటి తరగతిలో మీరు ఇప్పటికే ఒక సంయుక్త సూక్ష్మదర్శిని నిర్మాణం గురించి చదివారు, అయినప్పటికీ గుర్తు చేసుకోవడానికి, Fig. 12.1లో మీరు చూడగలిగినట్లుగా, ఒక సంయుక్త సూక్ష్మదర్శిని ఒక బేస్ ను కలిగి ఉంటుంది, దానిపై ఒక స్టేజ్ కేంద్ర రంధ్రంతో అమర్చబడి ఉంటుంది. బేస్కు జోడించబడిన ఒక ఆర్మ్ ఉంటుంది, దానికి ఒక బాడీ ట్యూబ్ అమర్చబడి ఉంటుంది, అది స్టేజ్ రంధ్రంతో సమలేఖనం చేయబడుతుంది. బాడీ ట్యూబ్ యొక్క దిగువ చివర, ఒక నోస్ పీస్ అమర్చబడి ఉంటుంది, దానిపై రెండు నుండి నాలుగు ఆబ్జెక్టివ్ లెన్సులు ఉండవచ్చు. నోస్ పీస్ను తిప్పడం ద్వారా, ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్లలో ఒకదాన్ని స్టేజ్పై ఉన్న రంధ్రం పైన ఉంచవచ్చు, అక్కడ చూడవలసిన వస్తువు గ్లాస్ స్లైడ్పై ఉంచబడుతుంది. బాడీ ట్యూబ్ యొక్క ఎగువ చివర, ఒక ఐపీస్ అమర్చబడి ఉంటుంది, దీని ద్వారా ఒక పరిశీలకుడు సూక్ష్మదర్శిని కింద చూడగలడు. ఆర్మ్పై సర్దుబాటు స్క్రూలు (కోర్స్ మరియు ఫైన్) ఉంటాయి, అవి స్టేజ్పై ఉన్న వస్తువు నుండి ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ దూరాన్ని సర్దుబాటు చేయడంలో సహాయపడతాయి. స్టేజ్ కింద, కాంతి మూలం ఉంటుంది (అది ప్రతిబింబించే అద్దం లేదా వస్తువును ప్రకాశింపచేయడానికి మరియు ఆబ్జెక్టివ్ లెన్స్ మరియు ఐపీస్ ద్వారా చిత్రం ఏర్పడటానికి సహాయపడే బల్బ్ కావచ్చు). అదనంగా, కాంతి మూలం మరియు స్టేజ్ మధ్య ఒక కండెన్సర్ ఉంటుంది, ఇది వస్తువుపై కాంతిని కేంద్రీకరించడానికి ముఖ్యమైనది. Fig. 12.2 ఒక సంయుక్త సూక్ష్మదర్శినిలో కాంతి మార్గాన్ని కూడా చూపిస్తుంది. ఆబ్జెక్టివ్ లెన్సులు మరియు ఐపీస్లు రెండూ వేర్వేరు వృద్ధి శక్తిని కలిగి ఉంటాయని మీరు గమనించి ఉండవచ్చు. ఒక విద్యార్థి సూక్ష్మదర్శినిలో ఐపీస్ యొక్క వృద్ధి శక్తి $10 \times$ లేదా $15 x$ మరియు నోస్ పీస్పై అమర్చబడిన వివిధ ఆబ్జెక్టివ్ లెన్సులు $4 \times$, $10 x, 40 / 45 x$ మరియు $100 x$ కలిగి ఉంటాయి. ఇప్పుడే చర్చించిన సూక్ష్మదర్శిని పద్ధతిని బ్రైట్ ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోపీ అని కూడా అంటారు, ఎందుకంటే చూడవలసిన వస్తువును ప్రకాశింపచేయడానికి కాంతి ఉపయోగించబడుతుంది. అందువల్ల, వస్తువు యొక్క వివిధ ప్రాంతాలను వేరు చేయడానికి, దానిని నిర్దిష్ట రంగులు లేదా స్టెయిన్తో రంగు వేస్తారు. కార్మిన్, ఈయోసిన్, సాఫ్రానిన్, మిథిలీన్ బ్లూ, జీమ్సా, మొదలైనవి కాంతి సూక్ష్మదర్శిని కోసం సాధారణంగా ఉపయోగించే కొన్ని స్టెయిన్లు.

Fig. 12.2: కాంతి సూక్ష్మదర్శిని

12.1.3 సూక్ష్మదర్శిని యొక్క వివిధ రూపాలు

ఊతకణజాలాల / కణాల అంతర్గత నిర్మాణం యొక్క సూక్ష్మ వివరాలను అధ్యయనం చేయడం చాలా విభిన్నమైనది కాబట్టి అది కేవలం కాంతి సూక్ష్మదర్శిని ద్వారా సాధించలేము. అందువల్ల, ఒక రకమైన మార్పు చేయడం ద్వారా, చాలా విభిన్న రూపాల సూక్ష్మదర్శిని ఉపయోగించబడుతుంది. అటువంటి ఒక మార్పులో, కేంద్ర కండెన్సర్ నుండి వస్తువుపై పడే కాంతిని ఒక డిస్క్ ద్వారా నిరోధించబడుతుంది మరియు వస్తువు యొక్క ప్రకాశం ఒక వక్ర కాంతి కిరణం ద్వారా చేయబడుతుంది, ఇది స్లైడ్ నుండి ప్రతిబింబించబడుతుంది మరియు చిత్రం చీకటి నేపథ్యంతో ప్రకాశిస్తుంది. అందువల్ల, అటువంటి సూక్ష్మదర్శినిని డార్క్ ఫీల్డ్ మైక్రోస్కోపీ అని పిలుస్తారు. మైటోకాండ్రియా, కేంద్రకాలు, రిక్తికలు మొదలైనవి దీనిని ఉపయోగించి సులభంగా గుర్తించబడతాయి. అదేవిధంగా, ఫేజ్ కంట్రాస్ట్ మైక్రోస్కోపీ అని పిలువబడే వేరొక రూపంలో, పారదర్శక వస్తువు గుండా వెళ్ళే కాంతి యొక్క తరంగ వ్యాప్తి మరియు దశ మార్పు చెందుతాయి. ఈ మార్పు వస్తువు లేదా నమూనా యొక్క భాగం యొక్క సాంద్రతపై ఆధారపడి ఉంటుంది. సాపేక్షంగా సాంద్రత ఎక్కువగా ఉన్న ప్రాంతంలో అటువంటి మార్పు ఎక్కువగా ఉంటుంది మరియు దీని ఫలితంగా, వస్తువు యొక్క వివిధ ప్రాంతాల యొక్క వైవిధ్యమైన కాంతి నిరోధకత చూడవచ్చు. ఇది కణాంగాలు మరియు క్రోమోజోముల అధ్యయనంలో ప్రత్యేకంగా ఉపయోగపడుతుంది. వస్తువు లేదా నమూనాను కొన్ని నిర్దిష్ట రంగులతో రంగు వేయడం రోజువారీగా చేస్తారు. కొన్ని ప్రత్యేక రకాల రంగులు ఉన్నాయి ఉదా., అక్రిడిన్ ఆరెంజ్, బిస్బెంజిమైడ్, మెరోసైనిన్ (ఫ్లోరోఫోర్లు అని కూడా పిలుస్తారు). ఈ రంగులు ప్రకాశించిన తర్వాత ఎక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం కలిగిన కాంతిని విడుదల చేసే సామర్థ్యాన్ని కలిగి ఉంటాయి, ఈ లక్షణాన్ని ఫ్లోరోసెన్స్ అంటారు. దీని ఫలితంగా, ఫ్లోరోఫోర్ రంగు వేయబడిన వస్తువు ఎక్కువగా ప్రకాశిస్తుంది మరియు ఉపయోగించిన రంగు ఆధారంగా వేరే రంగులో కనిపిస్తుంది. ఫ్లోరోసెన్స్ మైక్రోస్కోపీలో, అదే సూత్రం వర్తింపజేయబడుతుంది. చూడవలసిన వస్తువు ఒక నిర్దిష్ట భాగం లేదా అణువును అధ్యయనం చేయడానికి ఫ్లోరోఫోర్తో రంగు వేయబడుతుంది. ఫ్లోరోసెన్స్ సూక్ష్మదర్శిని కింద వస్తువును ప్రకాశించిన తర్వాత, నిర్దిష్టంగా రంగు వేయబడిన ప్రాంతం సులభంగా చూడబడుతుంది లేదా గమనించబడుతుంది. ఇది బ్యాక్టీరియా లేదా వైరస్లను గుర్తించడంలో మరియు ఇమ్యునోడయాగ్నోసిస్ కోసం ఇన్ఫెక్షన్ కారణాన్ని తెలుసుకోవడంలో ఉపయోగపడుతుంది.

ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శిని అనేది ఒక అత్యంత అధునాతన పద్ధతి, దీనిలో అధ్యయనం చేయవలసిన వస్తువు ఎలక్ట్రాన్ కిరణంతో బాంబు దాడి చేయబడుతుంది, ఇది దృశ్యమాన కాంతి కంటే సుమారు $1,00,000$ రెట్లు తక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం కలిగి ఉంటుంది. ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శినిలో ఎలక్ట్రాన్ కిరణం విద్యుదయస్కాంత లెన్స్ల సహాయంతో చిత్రాన్ని వృద్ధి చేస్తుంది. ఎలక్ట్రాన్ యొక్క మొత్తం ప్రయాణం శూన్యంలో ఉంటుంది మరియు ఉత్పత్తి చేయబడిన చిత్రం ఫ్లోరోసెంట్ స్క్రీన్పై చూడబడుతుంది మరియు ఐపీస్ ద్వారా కాదు. ఎలక్ట్రాన్ యొక్క చాలా తక్కువ తరంగదైర్ఘ్యం కారణంగా, ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శిని ద్వారా ఉత్పత్తి చేయబడిన చిత్రం చాలా ఎక్కువ రిజల్యూషన్ కలిగి ఉంటుంది. రెండు రకాల ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శిని ఉపయోగించబడుతుంది; ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ మరియు స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ. ట్రాన్స్మిషన్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీలో, వస్తువు లేదా నమూనా యొక్క అల్ట్రా-తిన్నని భారీ లోహ ఉప్పు (లెడ్, టంగ్స్టన్ మొదలైనవి) పూత పూయబడిన విభాగం చిత్రాన్ని సృష్టించడానికి ఎలక్ట్రాన్ కిరణం దాని గుండా వెళ్ళే విధంగా ఉంచబడుతుంది. ఎలక్ట్రాన్ సూక్ష్మదర్శిని యొక్క మరొక పద్ధతిలో, వస్తువు యొక్క బంగారు లేదా ప్లాటినం పూత పూయబడిన ఉపరితలం నుండి ప్రతిబింబించే ఎలక్ట్రాన్ కిరణం చిత్రాన్ని సృష్టిస్తుంది. ఈ పద్ధతిలో, వస్తువు ఉపరితలం యొక్క అత్యంత వృద్ధి చేయబడిన మరియు రిజల్వ్ చేయబడిన చిత్రం ఉత్పత్తి చేయబడుతుంది, అందువల్ల, దీనిని స్కానింగ్ ఎలక్ట్రాన్ మైక్రోస్కోపీ అంటారు.

గత రెండు మూడు దశాబ్దాలలో, మరొక అధునాతన సూక్ష్మదర్శిని ఇమేజింగ్ పద్ధతి అభివృద్ధి చేయబడింది మరియు ఉపయోగించబడుతుంది, దీనిని కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ అంటారు. కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీ స్థిర కణాలు/ఊతకణజాలాలలోని వివరమైన నిర్మాణాలను రిజల్వ్ చేయడంలో ఉపయోగపడుతుంది మరియు వస్తువుల యొక్క స్పష్టమైన చిత్రాలను ఇస్తుంది. కాన్ఫోకల్ మైక్రోస్కోపీని ఉపయోగించి ఒక వస్తువును పరీక్షించడానికి, అది మొదట ఫ్లోరోసెంట్గా లేబుల్ చేయబడుతుంది మరియు తర్వాత అధిక రిజల్యూషన్లో కాన్ఫోకల్ సూక్ష్మదర్శిని కింద విశ్లేషించబడుతుంది.

12.2 అపకేంద్రణ

మీరు అన్ని జీవుల కణాలలో ఉండే ప్రోటీన్లు, న్యూక్లిక్ ఆమ్లాలు మొదలైన వివిధ జీవ అణువుల గురించి చదివారు. ఈ జీవ అణువులను అధ్యయనం చేయడానికి, మీరు వాటిని ఒకటి లేదా మరొక వేరు చేయడం పద్ధతులను ఉపయోగించి వేరు చేయాలి. అపకేంద్రణ అనేది అటువంటి ఒక పద్ధతి, దీనిలో కణాలు లేదా అణువులు గురుత్వాకర్షణ శక్తి (g) ప్రభావంతో వాటి సాంద్రతల ఆధారంగా వేరు చేయబడతాయి, అపకేంద్రణ శక్తిని ఉపయోగించి అధిక వేగంతో ఒక అక్షం చుట్టూ ద్రావణంలో తిప్పడం ద్వారా. ఉపయోగించే పరికరాన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ అంటారు (Fig. 12.3), ఇది దాని ఉపయోగం ఆధారంగా వివిధ రకాలుగా ఉంటుంది. ఇది ఒక బేస్, ఒక తిరిగే కంటైనర్ (స్పిన్నింగ్ వెసెల్/రోటర్) మరియు ఒక మూతను కలిగి ఉంటుంది.

Fig. 12.3: సెంట్రిఫ్యూజ్ యొక్క ప్రాథమిక నిర్మాణం

స్పిన్నింగ్ వెసెల్లో అనేక సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్లు ఉంటాయి. కణ సారం లేదా మిశ్రమాన్ని సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్లలో తీసుకొని కావలసిన వేగంతో (రివల్యూషన్ పర్ మినిట్; rpm) నిర్దిష్ట కాలం పాటు తిప్పడం ద్వారా కణ పదార్థం సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్ల దిగువ భాగంలో స్థిరపడటానికి దారి తీస్తుంది.

12.2.1 అవక్షేపణ యొక్క ప్రాథమిక సూత్రాలు

అవక్షేపణ అనేది నిలుపుదలలో ఉన్న కణాలు వాటిని కలిగి ఉన్న ద్రవం నుండి బయటకు వచ్చి ఒక అడ్డంకికి వ్యతిరేకంగా విశ్రాంతి తీసుకోవడానికి ఉండే ధోరణి. ఇది వాటిపై పనిచేసే శక్తులకు ప్రతిస్పందనగా, ద్రవం గుండా వాటి చలనం కారణంగా ఉంటుంది. ఈ శక్తులు గురుత్వాకర్షణ మరియు అపకేంద్రణ శక్తుల కారణంగా ఉండవచ్చు.

12.2.2 సెంట్రిఫ్యూజ్ల రకాలు

వివిధ రకాల సెంట్రిఫ్యూజ్లు వాణిజ్యపరంగా లభ్యమవుతాయి. పరిశోధనా ప్రయోజనాల కోసం సాధారణంగా ఉపయోగించే సెంట్రిఫ్యూజ్లు:

• టేబుల్ టాప్/క్లినికల్ సెంట్రిఫ్యూజ్ లేదా మైక్రోఫ్యూజ్
• అధిక-వేగం సెంట్రిఫ్యూజ్
• అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూజ్
• డిఫరెన్షియల్ సెంట్రిఫ్యూజ్

పెద్ద-సామర్థ్యం ప్రిపరేటివ్ సెంట్రిఫ్యూజ్లు, అధిక వేగం రిఫ్రిజిరేటెడ్ సెంట్రిఫ్యూజ్లు మరియు అల్ట్రాసెంట్రిఫ్యూజ్లు సెంట్రిఫ్యూజ్ల యొక్క ప్రధాన రకాలు.

సూత్రం మరియు అనువర్తనం ఆధారంగా, క్రింది రకాల అపకేంద్రణలు నిర్వహించబడతాయి-

డిఫరెన్షియల్ అపకేంద్రణ- ఇది విభిన్న పరిమాణం మరియు సాంద్రత కలిగిన కణాల అవక్షేపణ రేటు (అపకేంద్రణ శక్తి) లోని తేడాలపై ఆధారపడి ఉంటుంది. ఇది పెద్ద కణ నిర్మాణాలు, కేంద్రక భాగం, మైటోకాండ్రియా, క్లోరోప్లాస్ట్లు లేదా పెద్ద ప్రోటీన్ను వేరు చేయడానికి ఉపయోగించబడుతుంది.

సాంద్రత-గ్రేడియంట్ అపకేంద్రణ- ఒకే పరిమాణం కలిగి కానీ సాంద్రతలలో భిన్నమైన జీవ కణాలను వేరు చేయడానికి, సాంద్రత గ్రేడియంట్ అపకేంద్రణను ఉపయోగించవచ్చు. ఈ రకమైన అపకేంద్రణలో, సెంట్రిఫ్యూజ్ ట్యూబ్లలో సాంద్రత గ్రేడియంట్ అభివృద్ధి చేయబడుతుంది. వాటి సాంద్రతలను బట్టి, వివిధ అణువులు వివిధ స్థాయిల