జీవసాంకేతిక శాస్త్రం జీవులను లేదా జీవుల నుండి ఎంజైమ్లను ఉపయోగించి మానవులకు ఉపయోగకరమైన ఉత్పత్తులు మరియు ప్రక్రియలను ఉత్పత్తి చేసే పద్ధతులతో వ్యవహరిస్తుంది. ఈ అర్థంలో, పెరుగు, బ్రెడ్ లేదా వైన్ తయారీ, ఇవన్నీ సూక్ష్మజీవుల ద్వారా జరిగే ప్రక్రియలు, కూడా జీవసాంకేతిక శాస్త్రం యొక్క ఒక రూపంగా భావించవచ్చు. అయితే, ఇది ఈ రోజు ఒక పరిమిత అర్థంలో ఉపయోగించబడుతుంది, అదే పనిని పెద్ద మొత్తంలో సాధించడానికి జన్యుపరంగా మార్పు చేయబడిన జీవులను ఉపయోగించే ప్రక్రియలను సూచించడానికి. ఇంకా, అనేక ఇతర ప్రక్రియలు/సాంకేతికతలు కూడా జీవసాంకేతిక శాస్త్రం కింద చేర్చబడ్డాయి. ఉదాహరణకు, ‘టెస్ట్-ట్యూబ్’ బిడ్డకు దారితీసే ఇన్ విట్రో ఫలదీకరణం, జన్యువును సంశ్లేషించడం మరియు దానిని ఉపయోగించడం, DNA వ్యాక్సిన్ అభివృద్ధి చేయడం లేదా లోపభూయిష్ట జన్యువును సరిచేయడం, ఇవన్నీ జీవసాంకేతిక శాస్త్రంలో భాగం.

యూరోపియన్ ఫెడరేషన్ ఆఫ్ బయోటెక్నాలజీ (EFB) సాంప్రదాయ దృక్పథం మరియు ఆధునిక అణు జీవసాంకేతిక శాస్త్రం రెండింటినీ కలిపే జీవసాంకేతిక శాస్త్రం యొక్క నిర్వచనాన్ని ఇచ్చింది. EFB చేత ఇవ్వబడిన నిర్వచనం క్రింది విధంగా ఉంది: ‘ఉత్పత్తులు మరియు సేవల కోసం సహజ శాస్త్రం మరియు జీవులు, కణాలు, వాటి భాగాలు మరియు అణు సారూప్యాల సమగ్రత’.

11.1 జీవసాంకేతిక శాస్త్రం యొక్క సూత్రాలు

చాలా మందిలో, ఆధునిక జీవసాంకేతిక శాస్త్రం యొక్క పుట్టుకను సాధ్యపరిచిన రెండు కోర్ సాంకేతికతలు:

(i) జన్యు ఇంజనీరింగ్: జన్యు పదార్థం (DNA మరియు RNA) యొక్క రసాయన శాస్త్రాన్ని మార్చడానికి, వాటిని హోస్ట్ జీవులలో ప్రవేశపెట్టడానికి మరియు తద్వారా హోస్ట్ జీవి యొక్క ఫీనోటైప్ను మార్చడానికి సాంకేతికతలు.

(ii) బయోప్రాసెస్ ఇంజనీరింగ్: కీటకనాశకాలు, వ్యాక్సిన్లు, ఎంజైమ్లు మొదలైన జీవసాంకేతిక ఉత్పత్తుల తయారీ కోసం పెద్ద మొత్తంలో కేవలం కావలసిన సూక్ష్మజీవి/యూకారియోటిక్ కణం పెరుగుదలను సాధ్యపరచడానికి రసాయన ఇంజనీరింగ్ ప్రక్రియలలో స్టెరైల్ (సూక్ష్మజీవి కాలుష్యం లేని) వాతావరణాన్ని నిర్వహించడం.

ఇప్పుడు జన్యు ఇంజనీరింగ్ సూత్రాల యొక్క సంభావిత అభివృద్ధిని అర్థం చేసుకుందాం. మీరు బహుశా అలైంగిక పునరుత్పత్తి కంటే లైంగిక పునరుత్పత్తి యొక్క ప్రయోజనాలను గుర్తించారు. మొదటిది వైవిధ్యాలకు మరియు జన్యు సెటప్ యొక్క ప్రత్యేక కలయికల రూపకల్పనకు అవకాశాలను అందిస్తుంది, వీటిలో కొన్ని జీవి మరియు జనాభాకు ప్రయోజనకరంగా ఉండవచ్చు. అలైంగిక పునరుత్పత్తి జన్యు సమాచారాన్ని సంరక్షిస్తుంది, అయితే లైంగిక పునరుత్పత్తి వైవిధ్యాన్ని అనుమతిస్తుంది. మొక్కలు మరియు జంతువుల పెంపకంలో ఉపయోగించే సాంప్రదాయ సంకరీకరణ విధానాలు, చాలా తరచుగా, కావలసిన జన్యువులతో పాటు అవాంఛిత జన్యువుల చేరిక మరియు గుణకారానికి దారి తీస్తాయి. పునఃసంయోజక DNA సృష్టి, జన్యు క్లోనింగ్ మరియు జన్యు బదిలీ ఉపయోగం వంటి జన్యు ఇంజనీరింగ్ సాంకేతికతలు ఈ పరిమితిని అధిగమించి, లక్ష్య జీవిలోకి అవాంఛిత జన్యువులను ప్రవేశపెట్టకుండా కేవలం ఒకటి లేదా కావలసిన జన్యువుల సమితిని వేరుచేసి ప్రవేశపెట్టడానికి అనుమతిస్తాయి.

ఏదో ఒక విధంగా ఒక విదేశీ జీవిలోకి బదిలీ చేయబడిన DNA ముక్క యొక్క సంభావ్య గతి మీకు తెలుసా? చాలా సంభావ్యత, ఈ DNA ముక్క జీవి యొక్క సంతతి కణాలలో దాన్ని దానే గుణించుకోలేదు. కానీ, అది గ్రహీత యొక్క జీనోమ్లోకి సమీకృతమైనప్పుడు, అది గుణించబడవచ్చు మరియు హోస్ట్ DNAతో పాటు వారసత్వంగా పొందవచ్చు. ఎందుకంటే విదేశీ DNA ముక్క క్రోమోజోమ్లో భాగమైంది, దీనికి ప్రతిరూపణ చేసే సామర్థ్యం ఉంది. ఒక క్రోమోజోమ్లో ప్రతిరూపణ మూలం అని పిలువబడే నిర్దిష్ట DNA క్రమం ఉంటుంది, ఇది ప్రతిరూపణను ప్రారంభించడానికి బాధ్యత వహిస్తుంది. అందువల్ల, ఏదైనా విదేశీ DNA ముక్క యొక్క గుణకారం కోసం ఒక జీవిలో, అది ‘ప్రతిరూపణ మూలం’గా పిలువబడే నిర్దిష్ట క్రమాన్ని కలిగి ఉన్న క్రోమోజోమ్(ల)లో భాగంగా ఉండాలి. అందువలన, ఒక విదేశీ DNA ప్రతిరూపణ మూలంతో లింక్ చేయబడుతుంది, తద్వారా, ఈ విదేశీ DNA ముక్క హోస్ట్ జీవిలో దాన్ని దానే ప్రతిరూపణ చేసుకోవచ్చు మరియు గుణించుకోవచ్చు. దీనిని క్లోనింగ్ లేదా ఏదైనా టెంప్లేట్ DNA యొక్క బహుళ సారూప్య కాపీలను తయారు చేయడం అని కూడా పిలుస్తారు.

ఇప్పుడు కృత్రిమ పునఃసంయోజక DNA అణువు నిర్మాణం యొక్క మొదటి ఉదాహరణపై దృష్టి పెడదాం. మొదటి పునఃసంయోజక DNA నిర్మాణం సాల్మోనెల్లా టైఫిమ్యూరియం యొక్క స్థానిక ప్లాస్మిడ్ (స్వయంప్రతిపత్తి ప్రతిరూపణ వృత్తాకార అతినికృష్ట క్రోమోజోమ్ DNA)తో యాంటీబయాటిక్ నిరోధకతను ఎన్కోడ్ చేసే జన్యువును లింక్ చేయడం యొక్క అవకాశం నుండి ఉద్భవించింది. స్టాన్లీ కోహెన్ మరియు హెర్బర్ట్ బోయర్ 1972లో యాంటీబయాటిక్ నిరోధకతను ప్రదానం చేసే ప్లాస్మిడ్ నుండి DNA ముక్కను కత్తిరించడం ద్వారా యాంటీబయాటిక్ నిరోధకత జన్యువును వేరుచేయడం ద్వారా దీనిని సాధించారు. నిర్దిష్ట స్థానాల వద్ద DNA కత్తిరింపు అని పిలువబడే ‘మాలిక్యులర్ కత్తెరలు’- పరిమితి ఎంజైమ్ల ఆవిష్కరణతో సాధ్యమైంది. కత్తిరించబడిన DNA ముక్క తరువాత ప్లాస్మిడ్ DNAతో లింక్ చేయబడింది. ఈ ప్లాస్మిడ్ DNA దానికి జోడించబడిన DNA ముక్కను బదిలీ చేయడానికి వెక్టర్లుగా పనిచేస్తాయి. మీరు బహుశా మలేరియా పరాన్నజీవిని మానవ శరీరంలోకి బదిలీ చేయడానికి దోమ ఒక కీటక వెక్టర్గా పనిచేస్తుందని తెలుసు. అదే విధంగా, ఒక ప్లాస్మిడ్ను హోస్ట్ జీవిలోకి విదేశీ DNA ముక్కను పంపిణీ చేయడానికి వెక్టర్గా ఉపయోగించవచ్చు. యాంటీబయాటిక్ నిరోధకత జన్యువును ప్లాస్మిడ్ వెక్టర్తో లింక్ చేయడం DNA లైగేజ్ ఎంజైమ్తో సాధ్యమైంది, ఇది కత్తిరించబడిన DNA అణువులపై పనిచేస్తుంది మరియు వాటి చివరలను కలుపుతుంది. ఇది ఇన్ విట్రోలో సృష్టించబడిన వృత్తాకార స్వయంప్రతిపత్తి ప్రతిరూపణ DNA యొక్క కొత్త కలయికను చేస్తుంది మరియు పునఃసంయోజక DNAగా పిలువబడుతుంది. ఈ DNA సాల్మోనెల్లాకు దగ్గరి సంబంధం ఉన్న బ్యాక్టీరియం ఎస్చెరిచియా కోలైలోకి బదిలీ చేయబడినప్పుడు, అది కొత్త హోస్ట్ యొక్క DNA పాలిమరేజ్ ఎంజైమ్ను ఉపయోగించి ప్రతిరూపణ చేసుకోగలదు మరియు బహుళ కాపీలను చేయగలదు. ఎ. కోలైలో యాంటీబయాటిక్ నిరోధకత జన్యువు యొక్క కాపీలను గుణించే సామర్థ్యాన్ని ఎ. కోలైలో యాంటీబయాటిక్ నిరోధకత జన్యువు క్లోనింగ్ అని పిలిచారు.

అందువలన మీరు ఒక జీవిని జన్యుపరంగా మార్చడంలో మూడు ప్రాథమిక దశలు ఉన్నాయని నిర్ధారించవచ్చు —

(i) కావలసిన జన్యువులతో DNA గుర్తింపు;

(ii) గుర్తించబడిన DNAని హోస్ట్లోకి పరిచయం చేయడం;

(iii) హోస్ట్లో పరిచయం చేయబడిన DNA నిర్వహణ మరియు DNAని దాని సంతతికి బదిలీ చేయడం.

11.2 పునఃసంయోజక DNA సాంకేతికత యొక్క సాధనాలు

ఇప్పుడు మనం పై చర్చ నుండి తెలుసుకున్నది, జన్యు ఇంజనీరింగ్ లేదా పునఃసంయోజక DNA సాంకేతికతను మనకు కీలక సాధనాలు ఉంటే మాత్రమే సాధించవచ్చు, అవి, పరిమితి ఎంజైమ్లు, పాలిమరేజ్ ఎంజైమ్లు, లైగేజ్లు, వెక్టర్లు మరియు హోస్ట్ జీవి. వీటిలో కొన్నింటిని వివరంగా అర్థం చేసుకోవడానికి ప్రయత్నిద్దాం.

11.2.1 పరిమితి ఎంజైమ్లు

1963 సంవత్సరంలో, ఎస్చెరిచియా కోలైలో బాక్టీరియోఫేజ్ పెరుగుదలను పరిమితం చేయడానికి బాధ్యత వహించే రెండు ఎంజైమ్లు వేరు చేయబడ్డాయి. వీటిలో ఒకటి DNAకి మిథైల్ సమూహాలను జోడించింది, మరొకటి DNAని కత్తిరించింది. తరువాతిది పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్ అని పిలువబడింది.

మొదటి పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్–హిండ్ II, దీని పనితీరు నిర్దిష్ట DNA న్యూక్లియోటైడ్ క్రమంపై ఆధారపడి ఉంటుంది, అయిదు సంవత్సరాల తరువాత వేరు చేయబడింది మరియు వర్గీకరించబడింది. హిండ్ II ఎల్లప్పుడూ ఆరు బేస్ జతల నిర్దిష్ట క్రమాన్ని గుర్తించడం ద్వారా ఒక నిర్దిష్ట బిందువు వద్ద DNA అణువులను కత్తిరిస్తుందని కనుగొనబడింది. ఈ నిర్దిష్ట బేస్ క్రమాన్ని హిండ్ II కోసం గుర్తింపు క్రమం అని పిలుస్తారు. హిండ్ II తో పాటు, ఈ రోజు మనకు 230 కంటే ఎక్కువ బ్యాక్టీరియా శాటాల నుండి వేరు చేయబడిన 900 కంటే ఎక్కువ పరిమితి ఎంజైమ్లు తెలుసు, వీటిలో ప్రతి ఒక్కటి వేర్వేరు గుర్తింపు క్రమాలను గుర్తిస్తాయి.

ఈ ఎంజైమ్లకు పేరు పెట్టే సంప్రదాయం ఏమిటంటే, పేరు యొక్క మొదటి అక్షరం జీనస్ నుండి వస్తుంది మరియు రెండవ రెండు అక్షరాలు వాటిని వేరు చేసిన ప్రోకారియోటిక్ కణం యొక్క జాతి నుండి వస్తాయి, ఉదా., ఎకోఆర్ఐ ఎస్చెరిచియా కోలై ఆర్వై 13 నుండి వస్తుంది. ఎకోఆర్ఐలో, ‘ఆర్’ అక్షరం స్ట్రెయిన్ పేరు నుండి ఉద్భవించింది. పేర్ల తరువాత రోమన్ సంఖ్యలు ఆ బ్యాక్టీరియా స్ట్రెయిన్ నుండి ఎంజైమ్లు వేరు చేయబడిన క్రమాన్ని సూచిస్తాయి.

పరిమితి ఎంజైమ్లు న్యూక్లియేజ్లు అని పిలువబడే పెద్ద తరగతి ఎంజైమ్లకు చెందినవి. ఇవి రెండు రకాలు; ఎక్సోన్యూక్లియేజ్లు మరియు ఎండోన్యూక్లియేజ్లు. ఎక్సోన్యూక్లియేజ్లు DNA చివరల నుండి న్యూక్లియోటైడ్లను తొలగిస్తాయి, అయితే, ఎండోన్యూక్లియేజ్లు DNA లోపల నిర్దిష్ట స్థానాల వద్ద కత్తిరింపులు చేస్తాయి.

ప్రతి పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్ DNA క్రమం యొక్క పొడవును ‘పరిశీలించడం’ ద్వారా పనిచేస్తుంది. అది దాని నిర్దిష్ట గుర్తింపు క్రమాన్ని కనుగొన్న తర్వాత, అది DNAకి బంధించబడుతుంది మరియు డబుల్ హెలిక్స్ యొక్క రెండు తంతువులను వాటి చక్కెర-ఫాస్ఫేట్ బ్యాక్బోన్లలో నిర్దిష్ట బిందువుల వద్ద కత్తిరిస్తుంది (చిత్రం 11.1). ప్రతి పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్ DNAలో నిర్దిష్ట పాలిండ్రోమిక్ న్యూక్లియోటైడ్ క్రమాలను గుర్తిస్తుంది.

చిత్రం 11.1 పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్ ఎంజైమ్ - ఎకోఆర్ఐ చర్య ద్వారా పునఃసంయోజక DNA ఏర్పాటు దశలు

పాలిండ్రోమ్లు ఏమిటో మీకు తెలుసా? ఇవి ముందుకు మరియు వెనుకకు రెండింటినీ చదివినప్పుడు ఒకే పదాలను ఏర్పరుచుకునే అక్షరాల సమూహాలు, ఉదా., “మలయాళం”. ఒక పద-పాలిండ్రోమ్కు వ్యతిరేకంగా, ఇక్కడ రెండు దిశలలో ఒకే పదం చదవబడుతుంది, DNAలోని పాలిండ్రోమ్ అనేది బేస్ జతల క్రమం, ఇది చదవడం యొక్క దృష్టిని ఒకే విధంగా ఉంచినప్పుడు రెండు తంతువులపై ఒకే విధంగా చదవబడుతుంది. ఉదాహరణకు, క్రింది క్రమాలు చదువుతాయి 5’ $\rightarrow$ 3’ దిశలో రెండు తంతువులపై ఒకే విధంగా. ఇది కూడా నిజం 3’ $\rightarrow$ 5’ దిశలో చదవండి

$ \begin{aligned} 5^{\prime}—– \text { GAATTC }—– 3^{\prime} \\ 3^{\prime}—–\text { CTTAAG }—–5^{\prime} \end{aligned} $

పరిమితి ఎంజైమ్లు పాలిండ్రోమ్ సైట్ల కేంద్రం నుండి కొద్దిగా దూరంలో DNA తంతువును కత్తిరిస్తాయి, కానీ వ్యతిరేక తంతువులపై ఒకే రెండు బేస్ల మధ్య. ఇది చివరల్లో ఒకే తంతువు భాగాలను వదిలివేస్తుంది. ప్రతి తంతువుపై స్టికీ ఎండ్స్ అని పిలువబడే ఓవర్హాంగింగ్ స్ట్రెచ్లు ఉన్నాయి (చిత్రం 11.1). వాటి పూరక కత్తిరించబడిన సహచరులతో హైడ్రోజన్ బంధాలను ఏర్పరుచుకున్నందున వీటికి ఈ పేరు పెట్టారు. చివరల యొక్క ఈ జిగురుతనం DNA లైగేజ్ ఎంజైమ్ యొక్క చర్యను సులభతరం చేస్తుంది.

పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్లు జన్యు ఇంజనీరింగ్లో ‘పునఃసంయోజక’ DNA అణువులను ఏర్పరచడానికి ఉపయోగించబడతాయి, ఇవి వివిధ మూలాలు/జీనోమ్ల నుండి DNAతో రూపొందించబడ్డాయి.

ఒకే పరిమితి ఎంజైమ్ ద్వారా కత్తిరించినప్పుడు, ఫలితంగా వచ్చే DNA ఖండాలు ఒకే రకమైన ‘స్టికీ-ఎండ్స్’ను కలిగి ఉంటాయి మరియు, వాటిని DNA లైగేజ్లను ఉపయోగించి కలిపవచ్చు (చివర నుండి చివరకు) (చిత్రం 11.2).

చిత్రం 11.2 పునఃసంయోజక DNA సాంకేతికత యొక్క రేఖాచిత్ర ప్రాతినిధ్యం

సాధారణంగా, ఒక వ్యక్తి వెక్టర్ మరియు మూల DNAని ఒకే పరిమితి ఎంజైమ్తో కత్తిరించకపోతే, పునఃసంయోజక వెక్టర్ అణువును సృష్టించలేమని మీరు గ్రహించి ఉండవచ్చు.

DNA ఖండాల వేరు చేయడం మరియు వేరు చేయడం: పరిమితి ఎండోన్యూక్లియేజ్ల ద్వారా DNA కత్తిరింపు DNA ఖండాలను ఫలితంగా ఇస్తుంది. ఈ ఖండాలను జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ అని పిలువబడే సాంకేతికత ద్వారా వేరు చేయవచ్చు. DNA ఖండాలు ప్రతికూలంగా చార్జ్ చేయబడిన అణువులు కాబట్టి, ఒక మాధ్యమం/మాతృక ద్వారా విద్యుత్ క్షేత్రం కింద యానోడ్ వైపు కదలడానికి బలవంతం చేయడం ద్వారా వాటిని వేరు చేయవచ్చు. ఈ రోజుల్లో అత్యంత సాధారణంగా ఉపయోగించే మాతృక అగరోజ్, ఇది సముద్రపు కలుపు నుండి సేకరించబడిన సహజ పాలిమర్. DNA ఖండాలు అగరోజ్ జెల్ ద్వారా అందించబడిన జల్లెడ ప్రభావం ద్వారా వాటి పరిమాణం ప్రకారం వేరు చేయబడతాయి (పరిష్కరించబడతాయి). అందువల్ల, ఖండం పరిమాణం చిన్నది, అది ఎంత దూరం కదులుతుంది. చిత్రం 11.3ని చూడండి మరియు నమూనా ఎక్కడ లోడ్ చేయబడిందో జెల్ చివర ఊహించండి.

చిత్రం 11.3 ఒక సాధారణ అగరోజ్ జెల్ ఎలక్ట్రోఫోరెసిస్ జీర్ణం కాని (లేన్ 1) మరియు జీర్ణమైన DNA ఖండాల సమితి (లేన్ 2 నుండి 4) యొక్క వలసను చూపిస్తుంది.

వేరు చేయబడిన DNA ఖండాలను DNAని ఎతిడియం బ్రోమైడ్తో ద్రవ్యరాశి చేసిన తర్వాత మాత్రమే దృశ్యమానం చేయవచ్చు, తర్వాత UV వికిరణానికి గురి చేయడం ద్వారా (మీరు దృశ్యమాన కాంతిలో మరియు ద్రవ్యరాశి లేకుండా స్వచ్ఛమైన DNA ఖండాలను చూడలేరు). UV కాంతికి గురైన ఎతిడియం బ్రోమైడ్తో ద్రవ్యరాశి చేసిన జెల్లో మీరు DNA యొక్క ప్రకాశవంతమైన నారింజ రంగు బ్యాండ్లను చూడవచ్చు (చిత్రం 11.3). వేరు చేయబడిన DNA బ్యాండ్లు అగరోజ్ జెల్ నుండి కత్తిరించబడతాయి మరియు జెల్ ముక్క నుండి సేకరించబడతాయి. ఈ దశను ఎల్యూషన్ అంటారు. ఈ విధంగా శుద్ధి చేయబడిన DNA ఖండాలు క్లోనింగ్ వెక్టర్లతో కలిపి పునఃసంయోజక DNA నిర్మాణంలో ఉపయోగించబడతాయి.

11.2.2 క్లోనింగ్ వెక్టర్లు

ప్లాస్మిడ్లు మరియు బాక్టీరియోఫేజ్లు క్రోమోజ