12.1 خرد بینی

خرد بین کے بغیر حیاتیاتی مطالعے اور تحقیقات کا تصور نہیں کیا جا سکتا کیونکہ یہ ہمیں ایسی چیز دیکھنے کے قابل بناتا ہے جو ہماری آنکھوں کی حد سے باہر ہے۔ آج، خرد بینی کی تکنیک اتنی ترقی یافتہ ہو چکی ہے کہ ایک محقق نہ صرف ایک انتہائی باریک ساخت کی انتہائی بڑھی ہوئی تصویر دیکھ سکتا ہے بلکہ ایسی اشیاء کی تہہ جاتی ساخت کو بھی دیکھ سکتا ہے۔ طاقتور الیکٹران خرد بینی تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے، بیکٹیریا اور وائرس کے ڈی این اے مالیکیول کو بھی دیکھا جا چکا ہے۔

پہلے خرد بین کے استعمال کی تاریخ 1665 سے ملتی ہے جب برطانوی طبیعیات دان رابرٹ ہوک نے بڑھانے والے لینسوں کے مجموعے (شکل 12.1) کا استعمال کرتے ہوئے ایک سادہ خرد بین ڈیزائن کیا اور کارک کے ٹکڑوں کا مشاہدہ کیا، اور اس شہد کی مکھی کے چھتے جیسی ساخت کے لیے Cellulae یا سیل کی اصطلاح وضع کی۔ آپ واقف ہیں کہ میتھیاس جیکب شلائیڈن اور تھیوڈور شوان نے 1838 میں پودوں اور جانوروں میں خلیوں کے مشاہدے کی بنیاد پر خلوی نظریہ پیش کیا تھا۔

شکل 12.1: خرد بین

12.1.1 تکبیر اور تفکیک

آئیے اب اس اصول پر توجہ مرکوز کرتے ہیں جس پر خرد بینی کی تکنیک مبنی ہے۔ خرد بین جیسے نوری آلے کے لیے دو نوری خصوصیات انتہائی اہم ہیں۔ ایک بڑھانے کی طاقت اور دوسری تفکیک کرنے کی صلاحیت۔

خرد بین کی تکبیر یا بڑھانے کی طاقت وہ صلاحیت ہے جس کے ذریعے شبکیہ تصویر کے سائز میں اضافہ کیا جا سکتا ہے۔ اس طرح سادہ الفاظ میں تکبیر یہ ہے -

خرد بین کی مدد سے شبکیہ تصویر کا سائز / خرد بین کے بغیر شبکیہ تصویر کا سائز

آپ نے طبیعیات میں پڑھا ہوگا کہ لینس کی تکبیر (M) مندرجہ ذیل فارمولوں کے مطابق ناپی جاتی ہے (جس میں $f$ لینس کی فوکل لمبائی ہے اور $d$ لینس سے شے کا فاصلہ ہے)۔

$$ M=\frac{f}{f-d} $$

عام طور پر، لیبارٹری میں استعمال ہونے والا خرد بین ایک مرکب خرد بین ہوتا ہے جس میں لینسوں کے دو سیٹ ہوتے ہیں۔ ایک کو آبجیکٹو لینس کہا جاتا ہے، جو دیکھی جانے والی شے کے قریب رہتا ہے، اور دوسرا آئی پیس ہے جس کے ذریعے مشاہدہ کرنے والا دیکھتا ہے۔ یہ کہنے کی ضرورت نہیں کہ شے، آبجیکٹو لینس، آئی پیس اور مشاہدہ کرنے والے کی آنکھ روشنی کے گزرنے کے لیے شے کی بڑھی ہوئی تصویر دیکھنے کے لیے ایک ہی لائن میں ہونی چاہئیں۔ سادہ لفظوں میں، خرد بین کی تکبیر آبجیکٹو لینس کی بڑھانے کی طاقت اور آئی پیس کی بڑھانے کی طاقت کا حاصل ضرب $\left(\mathrm{M} _{\mathrm{o}} \times \mathrm{M} _{\mathrm{e}}\right)$ ہے۔

تفکیکی طاقت خرد بین کی ایک اور اہم خصوصیت ہے، جو ایک دوسرے کے بہت قریب واقع دو اشیاء کی الگ الگ تصویریں بنانے کی صلاحیت ہے۔ اسے دو نقاط کے درمیان سب سے چھوٹے فاصلے سے ناپا جا سکتا ہے۔

12.1.2 روشنی خرد بین کا کام کرنا

آپ پچھلی کلاس میں مرکب خرد بین کی ساخت کے بارے میں پہلے ہی پڑھ چکے ہیں، پھر بھی یاد دہانی کے طور پر، جیسا کہ آپ شکل 12.1 میں دیکھ سکتے ہیں، ایک مرکب خرد بین ایک بیس پر مشتمل ہوتا ہے جس پر ایک اسٹیج ایک مرکزی سوراخ کے ساتھ فٹ ہوتا ہے۔ بیس سے ایک بازو منسلک ہوتا ہے جس پر ایک باڈی ٹیوب اس طرح فٹ کی جاتی ہے کہ یہ اسٹیج کے سوراخ کے ساتھ ہم خط ہو۔ باڈی ٹیوب کے نچلے سرے پر، ایک نوز پیس فٹ ہوتی ہے جس پر دو سے چار آبجیکٹو لینس موجود ہو سکتے ہیں۔ نوز پیس کو گھما کر، آبجیکٹو لینسز میں سے ایک کو اسٹیج پر موجود سوراخ کے اوپر رکھا جا سکتا ہے جہاں دیکھی جانے والی شے کو شیشے کی سلائڈ پر رکھا جاتا ہے۔ باڈی ٹیوب کے اوپری سرے پر، ایک آئی پیس فٹ ہوتی ہے جس کے ذریعے ایک مبصر خرد بین کے نیچے دیکھ سکتا ہے۔ بازو پر ایڈجسٹمنٹ سکرو (کورس اور فائن) ہوتے ہیں جو اسٹیج پر موجود شے سے آبجیکٹو لینس کے فاصلے کو ایڈجسٹ کرنے میں مدد دیتے ہیں۔ اسٹیج کے نیچے، روشنی کا ماخذ ہوتا ہے (جو شے کو روشن کرنے کے لیے ایک عکاسی آئینہ یا بلب ہو سکتا ہے اور آبجیکٹو لینس اور آئی پیس کے ذریعے تصویر کی تشکیل میں مدد دیتا ہے)۔ اس کے علاوہ، روشنی کے ماخذ اور اسٹیج کے درمیان ایک کنڈینسر موجود ہوتا ہے، جو شے پر روشنی فوکس کرنے کے لیے اہم ہے۔ شکل 12.2 ایک مرکب خرد بین میں روشنی کے راستے کو بھی دکھاتی ہے۔ آپ نے مشاہدہ کیا ہوگا کہ دونوں آبجیکٹو لینس اور آئی پیس مختلف بڑھانے کی طاقت کے ہوتے ہیں۔ ایک طالب علم خرد بین میں آئی پیس کی بڑھانے کی طاقت $10 \times$ یا $15 x$ ہوتی ہے اور نوز پیس پر فٹ مختلف آبجیکٹو لینسز کی بڑھانے کی طاقت $4 \times$، $10 x, 40 / 45 x$ اور $100 x$ ہوتی ہے۔ خرد بینی کی تکنیک جس پر ابھی بات ہوئی ہے اسے روشن میدان خرد بینی بھی کہا جاتا ہے کیونکہ دیکھی جانے والی شے کو روشن کرنے کے لیے روشنی کا استعمال کیا جاتا ہے۔ لہذا، شے کے مختلف علاقوں میں تمیز کرنے کے لیے، اسے مخصوص رنگوں یا داغ سے رنگا جاتا ہے۔ کارمائن، ایوسن، سیفرانن، میتھائلین بلو، گییمسا، وغیرہ، کچھ ایسے داغ ہیں جو عام طور پر روشنی خرد بینی کے لیے استعمال ہوتے ہیں۔

شکل 12.2: روشنی خرد بین

12.1.3 خرد بینی کی مختلف شکلیں

بافتوں/خلیوں کی اندرونی تنظیم کے باریک تفصیلات کا مطالعہ اتنا متنوع ہے کہ یہ صرف روشنی خرد بینی سے حاصل نہیں کیا جا سکتا۔ لہذا، ایک یا دوسری قسم کی چال چل کر، خرد بینی کی کافی متنوع شکلیں استعمال کی جاتی ہیں۔ ایسی ہی ایک چال میں، مرکزی کنڈینسر سے شے پر پڑنے والی روشنی کو ایک ڈسک سے روک دیا جاتا ہے اور شے کی روشنی ایک ترچھی روشنی کی شعاع سے کی جاتی ہے، جو سلائڈ سے منعکس ہوتی ہے اور تصویر تاریک پس منظر کے خلاف روشن ہوتی ہے۔ لہذا، ایسی خرد بینی کو تاریک میدان خرد بینی کے نام سے جانا جاتا ہے۔ مائٹوکونڈریا، مرکزے، خلیوں میں خالی جگہیں، وغیرہ، اس کا استعمال کرتے ہوئے آسانی سے پتہ لگایا جا سکتا ہے۔ اسی طرح، فیز کنٹراسٹ خرد بینی نامی ایک مختلف شکل میں، شفاف شے سے گزرنے والی روشنی کی لہر کا طول اور مرحلہ تبدیل ہو جاتا ہے۔ یہ تبدیلی شے یا نمونے کے حصے کی کثافت پر منحصر ہے۔ ایسا تغیر اس علاقے میں زیادہ ہوتا ہے جہاں کثافت نسبتاً زیادہ ہوتی ہے اور جس کے نتیجے میں، شے کے مختلف علاقوں کے مختلف کنٹراسٹ دیکھے جا سکتے ہیں۔ یہ خاص طور پر خلوی عضیات اور کروموسوم کے مطالعے میں مددگار ہے۔ شے یا نمونے کو کسی مخصوص داغ سے رنگنا معمول کے مطابق کیا جاتا ہے۔ کچھ خاص قسم کے داغ ہیں جیسے، ایکریڈین اورینج، بسبینزیمائیڈ، میروسائنین (جسے فلوروفورس بھی کہا جاتا ہے)۔ یہ داغ روشن ہونے کے بعد طویل طول موج کی روشنی خارج کرنے کی صلاحیت رکھتے ہیں، ایک خاصیت جسے فلوروسنس کہا جاتا ہے۔ اس کے نتیجے میں، فلوروفور سے رنگا ہوا شے زیادہ روشن اور استعمال ہونے والے داغ کے لحاظ سے مختلف رنگ کا نظر آتا ہے۔ فلوروسنس خرد بینی میں، یہی اصول لاگو ہوتا ہے۔ دیکھی جانے والی شے کو کسی مخصوص عضیہ یا مالیکیول کے حصے کا مطالعہ کرنے کے لیے فلوروفور سے رنگا جاتا ہے۔ فلوروسنس خرد بین کے نیچے شے کو روشن کرنے کے بعد، مخصوص طور پر رنگا ہوا علاقہ آسانی سے دیکھا یا مشاہدہ کیا جاتا ہے۔ یہ انفیکشن کی وجہ جاننے اور امیونوڈائیگنوسس کے لیے بیکٹیریا یا وائرس کی شناخت میں مددگار ہے۔

الیکٹران خرد بینی ایک انتہائی جدید تکنیک ہے جس میں مطالعہ کی جانے والی شے پر الیکٹران بیم سے بمباری کی جاتی ہے جو نظر آنے والی روشنی سے تقریباً $1,00,000$ گنا چھوٹی طول موج کی ہوتی ہے۔ الیکٹران خرد بین میں الیکٹران بیم برقی مقناطیسی لینسز کی مدد سے تصویر کو بڑھاتی ہے۔ الیکٹران کا پورا راستہ خلا میں ہوتا ہے اور پیدا ہونے والی تصویر ایک فلوروسنٹ اسکرین پر دیکھی جاتی ہے نہ کہ آئی پیس کے ذریعے۔ الیکٹران کی بہت چھوٹی طول موج کی وجہ سے، الیکٹران خرد بین سے پیدا ہونے والی تصویر انتہائی اعلیٰ تفکیک کی ہوتی ہے۔ دو قسم کی الیکٹران خرد بینی استعمال ہوتی ہے؛ ترسیلی الیکٹران خرد بینی اور اسکیننگ الیکٹران خرد بینی۔ ترسیلی الیکٹران خرد بینی میں، شے یا نمونے کے انتہائی پتلے بھاری دھاتی نمک (سیسہ، ٹنگسٹن، وغیرہ) سے لیپت حصے کو اس طرح رکھا جاتا ہے کہ الیکٹران بیم اس سے گزر کر تصویر بنائے۔ الیکٹران خرد بینی کی دوسری تکنیک میں، شے کی سونے یا پلاٹینم سے لیپت سطح سے منعکس ہونے والی الیکٹران بیم تصویر بناتی ہے۔ اس تکنیک میں، شے کی سطح کی انتہائی بڑھی ہوئی اور تفکیک شدہ تصویر پیدا ہوتی ہے، لہذا، اسے اسکیننگ الیکٹران خرد بینی کہا جاتا ہے۔

پچھلے دو تین دہائیوں میں، ایک اور زیادہ جدید خرد بینی امیجنگ تکنیک تیار کی گئی ہے اور استعمال کی جاتی ہے جسے کونفوکل خرد بینی کہا جاتا ہے۔ کونفوکل خرد بینی مقررہ خلیوں/بافتوں کے اندر تفصیلی ساختوں کو حل کرنے میں مفید ہے اور اشیاء کی واضح تصویریں دیتی ہے۔ کونفوکل خرد بینی کا استعمال کرتے ہوئے کسی شے کا معائنہ کرنے کے لیے، اسے پہلے فلوروسنٹلی لیبل کیا جاتا ہے اور پھر اعلیٰ تفکیک والے کونفوکل خرد بین کے تحت تجزیہ کیا جاتا ہے۔

12.2 مرکز گریزی

آپ نے تمام جانداروں کے خلیوں میں موجود مختلف حیاتیاتی مالیکیولز جیسے پروٹینز، نیوکلیک ایسڈز، وغیرہ کے بارے میں پڑھا ہے۔ ان حیاتیاتی مالیکیولز کا مطالعہ کرنے کے لیے، آپ کو انہیں ایک یا دوسری علیحدگی کی تکنیکوں کا استعمال کرتے ہوئے الگ کرنے کی ضرورت ہے۔ مرکز گریزی ایک ایسی تکنیک ہے جس میں ذرات یا مالیکیولز کو ان کی کثافتوں کی بنیاد پر ثقلی قوت (g) کے اثر میں، انہیں مرکز گریز قوت کا استعمال کرتے ہوئے ایک محور کے گرد تیز رفتار سے گھماتے ہوئے محلول میں الگ کیا جاتا ہے۔ استعمال ہونے والے سامان کو سینٹری فیوج کہا جاتا ہے (شکل 12.3)، جو اس کے استعمال کے لحاظ سے مختلف اقسام کا ہوتا ہے۔ یہ ایک بیس، ایک گھومنے والا کنٹینر (گھومنے والا برتن/روٹر) اور ایک ڈھکن پر مشتمل ہوتا ہے۔

شکل 12.3: سینٹری فیوج کی بنیادی ساخت

گھومنے والے برتن میں کئی سینٹری فیوج ٹیوبیں ہوتی ہیں۔ خلوی عرق یا مرکب کو سینٹری فیوج ٹیوبوں میں لیا جاتا ہے اور مطلوبہ رفتار (فی منٹ چکر؛ آر پی ایم) پر مخصوص مدت کے لیے گھومنے دیا جاتا ہے جس کے نتیجے میں ذراتی مواد سینٹری فیوج ٹیوبوں کے نیچے بیٹھ جاتا ہے۔

12.2.1 تہ نشینی کے بنیادی اصول

تہ نشینی معلق میں موجود ذرات کا اس سیال سے باہر بیٹھنے اور ایک رکاوٹ کے خلاف آرام کرنے کا رجحان ہے۔ یہ ان کے سیال کے ذریعے حرکت کی وجہ سے ہوتا ہے، ان پر عمل کرنے والی قوتوں کے جواب میں۔ یہ قوتیں کشش ثقل اور مرکز گریز قوتوں کی وجہ سے ہو سکتی ہیں۔

12.2.2 سینٹری فیوجز کی اقسام

تجارتی طور پر مختلف اقسام کے سینٹری فیوجز دستیاب ہیں۔ تحقیق کے مقاصد کے لیے عام طور پر استعمال ہونے والے سینٹری فیوجز یہ ہیں:

• ٹیبل ٹاپ/کلینیکل سینٹری فیوز یا مائکروفیوج
• ہائی اسپیڈ سینٹری فیوز
• الٹرا سینٹری فیوز
• ڈفرینشل سینٹری فیوز

بڑی گنجائش والے تیاری سینٹری فیوز، ہائی اسپیڈ ریفریجریٹڈ سینٹری فیوز اور الٹرا سینٹری فیوز سینٹری فیوز کی اہم اقسام ہیں۔

اصول اور اطلاق کی بنیاد پر، مندرجہ ذیل قسم کی مرکز گریزی کی جاتی ہے-

ڈفرینشل سینٹری فیوگیشن- یہ مختلف سائز اور کثافت کے ذرات کی تہ نشینی کی شرح (مرکز گریز قوت) میں فرق پر مبنی ہے۔ اس کا استعمال بڑی خلوی ساختوں، مرکزی حصے، مائٹوکونڈریا، کلوروپلاسٹ یا بڑے پروٹین کو الگ کرنے کے لیے کیا جاتا ہے۔

کثافت-گراڈینٹ سینٹری فیوگیشن- ایک جیسے سائز لیکن مختلف کثافتوں والے حیاتیاتی ذرات کو الگ کرنے کے لیے، کوئی کثافت گریڈینٹ سینٹری فیوگیشن کا استعمال کر سکتا ہے۔ اس قسم کی مرکز گریزی میں، سینٹری فیوز ٹیوبوں میں ایک کثافت گریڈینٹ تیار کیا جاتا ہے۔ ان کی کثافتوں کے لحاظ سے، مختلف مالیکیول مختلف سطحوں پر تہ نشین ہو جاتے ہیں۔ بھاری مالیکیول باہر کی طرف حرکت کرتے ہیں اور ہلکے والے سینٹری فیوز ٹیوبوں کے اندرونی حصے میں رہتے ہیں۔ کثافت میں جتنا زیادہ فرق ہوگا، وہ اتنی ہی تیزی سے حرکت کریں گے۔

الٹرا سینٹری فیوگیشن- جب مرکز گریزی انتہائی اعلیٰ رفتار پر کی جاتی ہے، یعنی $100,000 \mathrm{x} / \mathrm{g}$ یا اس سے زیادہ مالیکیولز کو الگ کرنے کے لیے، اسے الٹرا سینٹری فیوگیشن کہا جاتا ہے۔ الٹرا سینٹری فیوز میں، خلیے کو ارتکاز کی تقسیم کی مناسب پیمائش کے لیے حیاتیاتی ذرات سے روشنی کے گزرنے کی اجازت دینی ہوگی۔

12.3 برق پویان

برق پویان ایک برقی میدان کے اثر میں میکرو مالیکیولز کے چارج سے ماس کے تناسب کی بنیاد پر علیحدگی کا ایک طریقہ ہے۔ برق پویان ایک یونانی لفظ ہے جس کا مطلب ہے ‘الیکٹران برداشت کرنا’۔ سابقہ برق بجلی کی طرف اشارہ کرتا ہے جو مالیکیولز کو منتقل کرنے کے لیے درکار ہے اور لاحقہ پویان کا مطلب ہے ‘ہجرت’ یا ‘حرکت’۔ اس کا پہلی بار 1807 میں روسی پروفیسروں پیٹر ایوانووچ سٹراکوف اور فرڈینینڈ فریڈرک ریوس نے مشاہدہ کیا تھا۔ انہوں نے پانی میں بکھرے ہوئے مٹی کے ذرات کی مستقل برقی میدان کی موجودگی میں ہجرت محسوس کی۔

اصول

بہت سے اہم حیاتیاتی مالیکیول جیسے نیوکلیوٹائیڈز، ڈی این اے، آر این اے، پیپٹائیڈز اور پروٹینز آئنائز ایبل گروپس رکھتے ہیں، اور اس لیے کسی بھی دیے گئے $\mathrm{pH}$ پر بطور مثبت یا منفی آئن برقی طور پر چارج شدہ انواع کے طور پر محلول میں موجود ہوتے ہیں۔ برقی میدان کے اثر میں، یہ ذرات اپنے خالص چارج کے لحاظ سے، کیتھوڈ یا اینوڈ کی طرف ہجرت کریں گے۔

ایک مالیکیول کی حرکت پذیری اس کے سائز کے الٹ متناسب اور اس کے چارج کے راست متناسب ہوتی ہے، جس سے انہیں ایک دوسرے سے الگ کرنا ممکن ہوتا ہے۔

12.3.1 ایگاروز جیل برق پویان

اس قسم کی برق پویان میں، جیل ایگاروز مالیکیولز کا ایک میٹرکس ہوتا ہے جو ہائیڈروجن بانڈز کے ذریعے ایک دوسرے سے جڑے ہوتے ہیں اور چھوٹے چھوٹے سوراخ بناتے ہیں۔ ڈی این اے کی علیحدگی کے لیے جیلز اکثر ایک پولی سیکرائیڈ سے بنائے جاتے ہیں جسے ایگاروز کہتے ہیں، جو خشک، پاؤڈر کے فلیکس کی شکل میں آتا ہے۔ جب ایگاروز کو بفر میں گرم کیا جاتا ہے اور ٹھنڈا ہونے دیا جاتا ہے، تو یہ ایک ٹھوس، تھوڑا سا نرم جیل بنائے گا۔

جیل جیلی نما مواد کا ایک سلاب ہے، جسے جیل باکس میں رکھا جاتا ہے۔ باکس کا ایک سرا مثبت الیکٹروڈ سے جڑا ہوتا ہے، جبکہ دوسرا سرا منفی الیکٹروڈ سے جڑا ہوتا ہے۔ جیل باکس ایک نمک پر مشتمل بفر محلول سے بھرا ہوتا ہے جو کرنٹ چلا سکتا ہے۔ سوراخوں والے جیل کا سرا منفی الیکٹروڈ کی طرف رکھا جاتا ہے۔ جیل کا دوسرا سرا مثبت الیکٹروڈ کی طرف رکھا جاتا ہے جس کی طرف ڈی این اے کے ٹکڑے ہجرت کریں گے (شکل 12.4)۔

ڈی این اے مالیکیول منفی چارج شدہ ہوتے ہیں۔ ڈی این اے ٹکڑوں کی جیل برق پویان انہیں صرف سائز کی بنیاد پر الگ کرتی ہے۔ برق پویان کا استعمال کرتے ہوئے، ہم کسی نمونے میں موجود مختلف ڈی این اے ٹکڑوں کی جانچ کر سکتے ہیں اور ان کا مطلق سائز معلوم کر سکتے ہیں۔

شکل 12.4: نیوکلیک ایسڈ کو معلوم سائز کے ڈی این اے ٹکڑوں سے بنے ڈی این اے سیڑھی کی مدد سے الگ کرنے کے لیے ایگاروز جیل برق پویان یونٹ۔

جب پاور آن کی جاتی ہے، تو کرنٹ جیل کے ذریعے بہنا شروع ہو جاتی ہے۔ ڈی این اے مالیکیولز میں ان کی شوگر فاسفیٹ بنیاد میں فاسفیٹ گروپس کی موجودگی کی وجہ سے منفی چارج ہوتا ہے؛ لہذا، وہ جیل کے میٹرکس کے ذریعے مثبت الیکٹروڈ (اینوڈ) کی طرف حرکت کرتے ہیں۔

ایک ایگاروز ڈی این اے جیل چلانے کے لیے وولٹیج $80-120 \mathrm{~V}$ کی حد میں ہوتی ہے۔ جیسے ہی برقی کرنٹ لگائی جاتی ہے، ڈی این اے کے چھوٹے ٹکڑے جیل میٹرکس کے سوراخوں سے لمبے ٹکڑوں سے زیادہ تیزی سے گزرتے ہیں۔ اس طرح ڈی این اے کے لمبے ٹکڑے سوراخوں کے قریب رہتے ہیں جبکہ ڈی این اے کے چھوٹے ٹکڑے جیل کے مثبت سرے کے قریب ہوتے ہیں۔

12.3.2 ڈی این اے ٹکڑوں کو دیکھنا

ہدف ڈی این اے کو دیکھنے کے لیے استعمال ہونے والے سامان کو الٹرا وائلٹ (یو وی) ٹرانس-ایلومینیٹر کہا جاتا ہے۔ ایتھیڈیم برومائیڈ (ایٹی بی آر) شاید ڈی این اے کو دیکھنے کے لیے استعمال ہونے والا سب سے مشہور داغ ہے۔ یہ داغ جیل مرکب میں، برق پویان بفر میں ملایا جا سکتا ہے یا جیل چلنے کے بعد اسے داغا جاتا ہے۔ ایٹی بی آر کے مالیکیول ڈی این اے کے بیسز کے درمیان داخل ہوتے ہیں اور الٹرا وائلٹ روشنی کے تحت فلوروس کرتے ہیں۔ اس کے فوائد کے باوجود، ایتھیڈیم برومائیڈ ایک ممکنہ سرطان پیدا کرنے والا مادہ ہے، لہذا اسے انتہائی احتیاط سے ہینڈل کیا جانا چاہیے۔

شکل 12.5: یو وی روشنی کے تحت ڈی این اے بینڈز کو دیکھنا

12.3.3 پولی ایکریل امائیڈ جیل برق پویان (پیج)

پیج ایک تجزیاتی طریقہ ہے جو پروٹین مرکب کے اجزاء کو ان کے سائز کی بنیاد پر الگ کرنے کے لیے استعمال کیا جاتا ہے۔ پروٹین مالیکیولز کو یکساں چارج فراہم کرنے کے لیے، سوڈیم ڈوڈیسل سلفیٹ (ایس ڈی ایس) نامی ایک منفی ڈیٹرجنٹ کا استعمال پروٹینز کو باندھنے اور انہیں منفی چارج دینے کے لیے کیا جاتا ہے۔ پھر پروٹینز کو پولی ایکریل امائیڈ سے بنے جیل میٹرکس کا استعمال کرتے ہوئے ایک برقی میدان میں ان کے سائز کے مطابق برقی طور پر الگ کیا جاتا ہے۔

پولی ایکریل امائیڈ ایکریل امائیڈ اور $\mathrm{N}, \mathrm{N}^{\prime}-$ میتھیلین-بس-ایکریل امائیڈ (بی آئی ایس) کے درمیان پولیمرائزیشن رد عمل کے نتیجے میں ایک کیٹالسٹ کا استعمال کرتے ہوئے پیدا ہوتا ہے۔ پولیمرائزیشن یا کراس لنکنگ کی ڈگری کو ایکریل امائیڈ اور بی آئی ایس کی ارتکاز کو ایڈجسٹ کرکے کنٹرول کیا جا سکتا ہے۔ کراس لنکنگ جتنی زیادہ ہوگی، جیل اتنا ہی سخت ہوگا۔ جیل کی سختی، بدلے میں، میکرو مالیکیولز کے ذریعے پیج کے دوران جیل سے گزرتے وقت تجربہ کیے جانے والے رگڑ کو کنٹرول کرتی ہے، اس طرح علیحدگی کی تفکیک کو متاثر کرتی ہے۔ ڈھیلے جیل (4-8% ایکریل امائیڈ) اعلیٰ سالماتی وزن والے مالیکیولز کو جیل کے ذریعے تیزی سے ہجرت کرنے کی اجازت دیتے ہیں جبکہ سخت جیل $(12-20 %$ ایکریل امائیڈ) بڑے مالیکیولز کی ہجرت کو محدود کرتے ہیں اور چھوٹے مالیکیولز کو منتخبی طور پر جیل سے گزرنے کی اجازت دیتے ہیں۔

12.3.4 ٹریکنگ ڈائی

چونکہ ڈی این اے، آر این اے اور پروٹینز زیادہ تر بے رنگ ہوتے ہیں، برق پویان کے دوران جیل کے ذریعے ان کی پیشرفت کو آسانی سے نہیں دیکھا جا سکتا۔ لہذا، معلوم برقی پویان نقل و حرکت والے منفی رنگوں کو عام طور پر نمونہ بفر میں شامل کیا جاتا ہے۔ ایک بہت عام ٹریکنگ ڈائی بروموفینول بلو ہے۔ یہ ڈائی الکلی اور غیر جانبدار $\mathrm{pH}$ پر رنگین ہوتا ہے، اور یہ ایک چھوٹا منفی چارج شدہ مالیکیول ہے جو اینوڈ کی طرف حرکت کرتا ہے اور یہ الکلی اور غیر جانبدار $\mathrm{pH}$ پر رنگین ہوتا ہے۔ انتہائی متحرک مالیکیول ہونے کی وجہ سے یہ زیادہ تر پروٹینز اور نیوکلیک ایسڈز سے آگے بڑھ جاتا ہے۔ جیسے ہی یہ برق پویان میڈیم کے اینوڈک سرے تک پہنچتا ہے، برق پویان روک دی جاتی ہے۔ دیگر عام ٹریکنگ ڈائی زائلین سیانول ہیں، جس کی نقل و حرکت کم ہوتی ہے، اور اورینج جی، جس کی نقل و حرکت زیادہ ہوتی ہے۔ جیل پر پروٹین کو دیکھنا-کوماسی برلیئنٹ بلو $\mathrm{R}-250$ سب سے مقبول پروٹین داغ ہے۔ یہ ایک منفی ڈائی ہے، جو غیر مخصوص طور پر پروٹینز سے بندھتی ہے۔ جیل میں پروٹینز کو ایسیٹک ایسڈ سے مقرر کیا جاتا ہے اور بیک وقت داغا جاتا ہے۔ جیل میں شامل اضافی ڈائی کو بغیر ڈائی کے اسی محلول سے ڈی سٹیننگ کرکے ہٹایا جا سکتا ہے۔ پروٹینز کو صاف پس منظر پر نیلے بینڈز کے طور پر پتہ چلتا ہے۔ داغنے (پروٹین مخصوص) تکنیک کے ذریعے دیکھنے کے بعد، پروٹین کے سائز کا حساب معلوم سالماتی وزن کی سیڑھی کے ساتھ اس کی ہجرت کے فاصلے کا موازنہ کرکے لگایا جا سکتا ہے۔

باکس 1

جیلی کی خاصیت کا حیرت انگیز دریافت

ایک جاپانی شہنشاہ اور اس کی شاہی پارٹی برفانی طوفان کے دوران پہاڑوں میں کھو گئے اور ایک چھوٹے سے سرائے پر پہنچے؛ ان کے ساتھ سرائے والے نے سمندری سوار سے بنی جیلی ڈش کے ساتھ کھانا پیش کیا۔ شاید سرائے والے نے بہت زیادہ جیلی تیار کر لی تھی یا ذائقہ اتنا خوشگوار نہیں تھا لیکن کچھ جیلی پھینک دی گئی، رات کے دوران جم گئی اور بعد میں پگھلنے اور نکاس کے بعد ٹوٹ گئی، کم کثافت کی ایک ٹوٹی ہوئی مادہ چھوڑ گئی۔ سرائے والے نے باقیات کو لیا اور، اس کے حیرت کے لیے، پایا کہ اسے